Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
в свою очередь соединены друг с другом канавками, пересекающими
перегородку на обоих концах. Кроме того, секторы имеют в своей узкой
части, как обычно, тонкие каналы (не видны на рисунке) для заполнения в
собранной ячейке.
Подготовку ячейки для САФ производят следующим образом. Сердечник
помещают отверстиями колодцев кверху в корпус ячейки на уже установленное
на свое место нижнее окно. В правый колодец микрошприцем вводят 10-15 мкл
фермента в легком буфере, левый наполняют таким же объемом буфера либо-
оставляют пустым. После этого осторожно, следя за тем, чтобы из-колодцев
не выдавились растворы, вставляют оправу с верхним окном и заканчивают
сборку ячейки. Если секторы сохранились в чистоте, в правый сектор
(сектор А) вводят 0,33-0,35 мл раствора субстратов в буфере с повышенной
плотностью. В левый сектор (сектор В) помещают либо такой же объем, либо,
если левый колодец оставлен пустым, соответственно больший объем тяжелого
буфера. Субстрат, изменяющий под действием фермен-
182
та свою оптическую плотность, или рН-индикатор вводят в сектор А или в
оба сектора с таким расчетом, чтобы при сканировании получить границы
того или иного типа из представленных на рис. 2.
В качестве низкомолекулярного вещества применяют глицерин <5%) [9],
D2O (50%) [14]> NaCl (0,1 М) или (в опытах без рН-индикатора) буферные
соли (0,1 М) [8, 15].
Количество наслаиваемого фермента подбирают, исходя из его удельной
активности, ожидаемого коэффициента седиментации, объема, который будет
налит в колодец, скорости вращения ротора и экстинкции того из реагентов,
который изменяет в ходе реакции оптическую плотность раствора.
Ориентироваться при этом следует на такую активность в ячейке, чтобы за
время седиментации фермента на ширину зоны оптическая плотность
изменялась не менее чем на 0,25 ед. и не более чем на
1,00 [7]. Скорость вращения должна быть максимальной, чтобы седиментация
происходила быстрее, чем диффузионное расплывание полосы. (Последнее
протекает в полосовых опытах намного быстрее, чем в обычных [4] ; так, в
опыте с глюкозо-6-фосфат дегидрогеназой в центре полосы концентрация
через 40 мин составляла всего 27% от начальной [7]). Однако для ферментов
с большим коэффициентом седиментации скорость вращения должна позволить
произвести по меньшей мере 6 сканирований с интервалом не менее времени
перемещения полосы на свою толщину. Для ориентировочных расчетов при
подготовке опытов в табл. 1 приводится начальная толщина полосы при
разных объемах фермента, вычисленная из геометрических соображений, а в
табл. 2 - время перемещения полосы (образующейся при объеме 10 мкл) на
свою толщину (0,031 см) в зависимости от коэффициента седиментации
фермента и скорости вращения ротора.
Для подбора такого количества фермента, которое обеспечит изменение
оптической плотности в данном растворе субстратов примерно на 1,0 (в
полосовой двухсекторной ячейке), можно воспользоваться приближенной
формулой:
Таблица 1
Начальная толщина полосы с ферментом (бго) при разных
объемах (с) в колодце и скорости вращения ротора в об/мян
V, мкл 5 10 15
б/-0, см 0,015 0,031 0,046
Таблица 2
Время (Л*), за которое полоса, образующаяся при и = 10
мкл, перемещается на свою толщину (0,031 см) в зависимости от s фермента
и скорости вращения ротора в об/мин
s (S) Д^, мин
68 000 60 000 52 000
2 8,1 10,4 13,8
3 5,4 6,9 9,2
5 3,2 4,2 5,5
7 2,3 3,0 4,0
10 1,6 2,1 2,8
13 1,3 1,6 2,1
183
u=3,40-10-12n2s(S).
Здесь количество фермента и измеряется в единицах, определенных так, что
в спектрофотометрической кювете с 3 мл того же раствора субстратов одна
единица фермента вызывает изменение абсорбции на 0,01 за минуту (при
длине оптического пути 1 см); п - скорость вращения ротора в об/мин; s(S)
- коэффициент седиментации фермента в сведбергах. Если принято решение
ограничиться в опыте изменением оптической плотности менее чем на 1,0, то
надо соответственно уменьшить и.
После того как по этой формуле вычислено количество фермента,
необходимо убедиться, что будет выполняться условие постоянства скорости
реакции во всей полосе. Проще всего это сделать в спектрофотометре,
проверив, постоянна ли активность выбранного количества фермента в
заданном диапазоне оптической плотности.
Окончательное подтверждение правильности полученного результата можно
получить только путем повторения полосовых опытов, варьируя концентрации
(объем, заливаемый в колодец, сохраняют неизменным): в некотором
диапазоне коэффициент седиментации воспроизводится с точностью не хуже
±(2-3)%, а при дальнейшем увеличении концентрации быстро возрастает из-за
перегрузки полосы. Дополнительным критерием служит близость результатов
вычислений, проделанных по методам полу-высоты границы и разностных
