Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
А34б •
171
/уже отмечалось, адиабатическое изменение температуры составляет 2°/1000
атм.
Описываемый вариант кюветы не имеет встроенного термодатчика, и
температурный режим калибровали в специальных опытах по ртутному
термометру, погруженному в заполненную водой и подключенную к
ультратермостату кювету высокого давления. Многократные измерения
позволяют заключить, что точность установки температуры в кинетических
опытах составляла ±0,3° С. Время, необходимое для выравнивания
температуры на заданном уровне после быстрого (5 с) повышения давления от
1 до 1000 атм, можно свести примерно к 1 мин, если кювета была
предварительно термостатирована.
Величина давления измеряется контрольным манометром с ценой деления
10 атм.
Кинетика лактатдегидрогеназной реакции под гидростатическим
давлением
Для первых исследований в кювете высокого давления, разработанной в
Межфакультетской лаборатории им. А. Н. Белозерского МГУ, была избрана
лактатдегидрогеназа из мышц кролика (ЕС 1.1.1.27), сокращенно ЛДГ-М4. Она
является одним из наиболее изученных ферментов гликолитического цикла и,
что для нас было особенно важно, интенсивно исследовалась с применением
высокого гидростатического давления [24, 26, 32-35].
ЛДГ состоит из четырех субъединиц, ковалентно не связанных между
собой, и поэтому потенциально способна диссоциировать под давлением, если
определенный согласно формуле (25) парциальный мольный объем ассоциации
AVs>0. Действительно, как показано в [26, 36], после 20 мин выдержки при
2000 агм ЛДГ-М4 (из мышцы свиньи) диссоциирует на лишенные активности
мономеры. Кроме того, оказалось, что при Р 1000 атм диссоциация и
инактивация полностью обратимы. Исследовав кинетические и равновесные
характеристики этих реакций, авторы [26] нашли, что для холо-ЛДГ-М4 из
мышцы свиньи парциальный активационный объем диссоциации -231
мл/моль, а
парциальный объем реакции диссоциации ДК=-390 мл/моль.
В наших опытах использовалась лактатдегидрогеназа из мышц кролика
(ЛДГ-М4) ("Серва") с удельной активностью 550 ИЕ/мг. В качестве буфера
был избран трис ("Сигма"), поскольку в нем мал эффект давления на pH
[37]. Стандартная реакционная среда состояла из 0,2 М трис-WCA буфера pH
7,6, 10 мМ дитиоэритритола ("Серва"), 1 мМ ЭДТА ("Реанал"), 0,8 мМ
пирувата Na ("Сигма") и 0,16 - 0,2 мМ НАДН ("Реанал") .
Концентрация ЛДГ-М* составляла 0,093 мкг/мл в опытах при 1 атм и
0,372 мкг/мл в измерениях при 1000 атм. Эти концентрации фермента были
подобраны так, чтобы начальные скорости
172
реакций при 1 атм и при 1000 атм не сильно различались и составляли
примерно ^0,1 ед. оптической плотности (340 нм) в мин. Все опыты
проводили при 25° С в диапазоне давлений от 1 атм до 1000 атм.
Изменение оптической плотности в процессе лактатдегидроге-назной
реакции регистрировали в модифицированном спектрофотометре "Спекорд УФ-
ВИЗ" (Цейсс, ГДР). Модификация была направлена на то, чтобы получить
возможность измерять изменения оптической плотности с максимальной для
данного прибора чувствительностью - примерно 0,1 ед. оптической плотности
на шкалу (в диапазоне 80-100% пропускания) - при начальной оптической
плотности 1-1,2. Для решения этой задачи в линию •сравнения
спектрофотометра в кюветном отделении вставляли круговой оптический
ослабитель. Управление ослабителем вывели наружу, так что его положение
можно быстро изменять при закрытой крышке кюветного отделения и
компенсировать исходную абсорбцию реакционной среды.
Это позволило измерять начальные скорости реакции при достаточно высокой
концентрации НАДН (К т - 11 мкМ [38]) и небольшой глубине превращения
субстрата (менее 2% пирувата). На рис. 2 показана типичная запись
кинетики лактатдегидрогеназной реакции для определения начальной
скорости.
В описанных условиях кинетика, как показали контрольные опыты, оставалась
линейной не менее 10 мин.
На рис. 3 представлен один из экспериментальных графиков зависимости
активности ЛДГ от времени при давлении 1000 атм.
Отрезки горизонтальных прямых, которые начинаются в момент запуска
реакции, показывают, что при взаимодействии с пирува-том ЛДГ из мышц
кролика приобретает устойчивость к давлению (по крайней мере в
присутствии достаточного количества пирувата).
Пунктиром на рис. 3 показана экстраполяция экспериментальных данных к
моменту приложения давления (^=0). Как видно, найденная таким способом
"начальная скорость vPt=D- -0,053 мкмоль НАДН/мин уже существенно
отличается от vP=0 = = 0,091 мкмоль НАДН/мин, измеренной при тех же
условиях, но при
1 атм. Падение iff(r) по сравнению с иР=0 происходит со скоростью, которая
превышает возможности наблюдения нашим методом й либо характеризует
первую фазу воздействия высокого
Рис. 3. Зависимость активности ЛДГ от
продолжительности выдержки под давлением 1000 атм до пуска реакции
173
давления на ЛДГ, либо в исследовавшейся серии фермента присутствовала
