Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
объема реакции ассоциации, но распространенной ситуацией является, по-
видимому, большое и положительное значение AVS. Это означает в соответ-
т
ствии с (25), что J]v?V?<Ve. Иными словами, когда субъ-
<=]
единицы выходят в раствор, их парциальный мольный объем уменьшается. Это
может происходить из-за гидратации межсубъ-единичных участков, вступающих
в контакт с водой, и, в частности, из-за заполнения водой пустот, которые
иногда существуют в этих местах в интактной мультимерной макромолекуле
[20].
Таким образом, опыты под давлением не дают однозначной информации об
оъемных эффектах в мультисубъединичных ферментах.
Однако важной особенностью исследований ряда ферментов под давлением
является обратимость реакции диссоциации - ассоциации и сопряженной с ней
инактивацией - реактивацией [21]. Поскольку обратная ассоциация
субъединиц в нативный фермент в тех случаях, когда она возможна, требует
некоторого времени, главным критерием того, что_опыты под давлением дают
истинные активационные объемы ДУ^, должна быть быстрая обратимость
действия давления на скорость реакции. Действительно, если единственной
причиной изменения скорости является
167
непосредственное воздействие давления на стадию образования
активированного комплекса, то согласно формулам (4) и (5) снятие давления
должно приводить к очень быстрому восстановлению исходной активности
фермента.
Морилд [10] подробно разобрал важный частный случай исследования
фермента, состоящего из двух субъединиц.
Техника эксперимента
Устройства для изучения влияния гидростатического давления на ферменты
различаются в зависимости от цели исследований, избранного способа
наблюдения и от диапазона давлений. Выше
2-3 тыс. атм изучаются преимущественно денатурационные изменения, а при
давлениях до 1-2 тыс. атм - главным образом объемные эффекты,
сопровождающие ферментативные реакции.
В исследованиях ферментативной кинетики наибольшие затруднения
вызывает проблема сокращения интервала времени между началом реакции и
началом ее регистрации. Чаще всего (см. напрамер, [23-26]) реакция
запускается при атмосферном давлении, после чего кювету герметизируют,
устанавливают в регистрирующий прибор и поднимают давление. И лишь через
1-3 мин, в течение которых устанавливается на заданном уровне температура
раствора, возрастающая при адиабатическом повышении давления примерно на
2° С/1000 атм [24], начинают регистрировать ход реакции. Таким образом,
начальный участок реакции на протяжении 2-8 мин остается вне наблюдения.
Более того, в большей части работ (например, [19, 23-26]) активность
измерялась лишь после извлечения раствора из кюветы, в которой он
определенное время выдерживался под далением.
Для запуска реакции под давлением предложены кюветы с бойком, который
в нужное время разбивает перегородку, отделяющую друг от друга
находящиеся под давлением реагенты, и перемешивает их [27-28]. Первая из
этих кювет ([27]) рассчитана на последующую регистрацию кинетики в
спектрофотометре, но мертвое время между запуском реакции и началом
измерений едва ли можно сделать меньше 10 с. Вторая кювета ([28]) не
предназначена для непосредственных оптических измерений. Она снабжена
шприцевым устройством для отбора проб без декомпреС' сии раствора и
определения активности через заданные промежутки времени.
Много информации получено с помощью разнообразных устройств для
исследований релаксационной кинетики после скачкообразного изменения
какого-либо параметра, в частности давления [29]. Очень интересный прибор
для исследования быстрой кинетики под давлением (до 1200 атм) с помощью
метода остановленной струи описан недавно Эремансом [30].
В тех случаях, когда ферментативная реакция сопровождается изменением
оптической плотности реакционной среды, естественно использовать
абсорбционную спектрофотометрию.
168
В Межфакультетской проблемной лаборатории молекулярной биологии и
биоорганической химии им. А. Н. Белозерского Московского университета
разработана спектрофотометрическая кювета, позволяющая начинать реакцию
через произвольное время после повышения давления, причем до начала
реакции фермент может находиться либо под высоким давлением, либо при 1
атм. В любом случае регистрация кинетики начинается примерно через
секунду (или раньше) после начала реакции [31].
На рис. 1 Л и 1 ? показаны схемы ячейки для проведения реакции и
кюветы высокого давления. Ячейка (1) имеет цилиндрическую форму,
изготовлена из полированного снаружи и изнутри
А
3 7 1 2
9 7. 8
Рис. 1. Кювета высокого давления. А - ячейка для запуска и проведения
ферментативной реакции под гидростатическим давлением: 1-цилиндрическая
ячейка; 2 - стальная шайба, закрепленная в дне ячейки; 3 - пластмассовая
чашка; 4 - постоянный магнит, приклеенный к чашке; 5 - коническая крышка
