Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
протаминсульфатом на одной из стадий очистки. Супернатант прогревали в
течение 10 мин на кипящей водяной бане, отделяли коагулировавшие белки н
фракцию, содержавшую активатор, получали путем высаливания сульфатом
аммония до 60%-ного насыщения с последующим диализом. Как следует из
данных табл. 2, эта термостабильная белковая фракция активирует НАД-
киназу из сердца голубя в 1,3-
2,0 раза в зависимости от добавленного количества. По-видимому, как и в
случае фермента из печени, эффект активатора на НАД-киназу из сердца
голубя специфичен, так как добавление БСА в' том же количестве не
оказывало никакого влияния на активность фермента.
Следует заметить, что активирующая НАД-киназу фракция
151
из сердца голубя способна также активировать НАД-ки-назу из печени
кролика. В свою очередь добавление фракции, содержащей активатор из
печени кролика, вызывает активацию фермента и" сердца голубя.
В настоящее время фактор - регулятор активности НАД-киназы из печени
кролика и сердца голубя - ие выделен в гомогенном состоянии. Выделение и
очистка регулятора активности НАД-киназьи представляются задачей
первостепенной важности. Имея очищенный активатор, можно будет однозначно
решить вопрос о его участии в поддёржании четвертичной структуры и о
влиянии на степень олигомеризации фермента, а следовательно, о той роли,
которую он играет в регуляции каталитической активности.
Возникает вопрос, не является ли этот фактор белком, подобным
кальмодулину. Судя по имеющимся данным, активатор НАД-киназы из сердца
голубя и печени кролика существенно отличается от кальмодулина. Так,
кальмодулин-активатор НАД-киназьЕ из высших растений и яиц морского ежа
прочно связываете" с ионообмёнником и сходит с колонки значительно позже
НАД-киназы, тогда как активатор фермента из печени кролика-в тех же
условиях вовсе не связывается с ионообменником. Далее, фермент из
растительных объектов после отделения кальмодулина полностью утрачивает
активность, что дало основание рассматривать кальмодулин как субъединицу
этих ферментов. НАД-ки-наза из сердца голубя и печени кролика после
ионообменной хроматографии сохраняет активность; более того, наблюдается
значительная очистка фермента за счет отделения примесных белков. Однако
при этом разрушается четвертичная структура фермента: из сердца голубя,
который после такой процедуры представляет собой мономер, не способный к
ассоциации.
Следует признать, что сам факт сохранения активности фермента после
фракционирования на ионообменнике хотя и является признаком, по которому
различаются НАД-киназы животного и растительного происхождения, тем не
менее он ие исключает" возможности регуляции кальмодулином активности
фермента из животных тканей. Прямой ответ на поставленный вопрос можно-
было бы получить только исследуя влияние очищенного кальмодулина на
гомогенный препарат фермента из печени кролика № сердца голубя.
Интересно отметить, что НАД-киназа из проростков гороха также
представлена множественными формами. Было обнаруже-
Таблица 2
Влияние активатора на активность НАД-киназы из сердца голубя (24)
№ Ф*р- Активатор, БСА, Актив
пробы нент, 14 КГ мкг ность,
ыкг ед./иг
1 96 0,80
2 96 120 --- 1,06
3 96 360 --- 1,37
4 96 600 --- 1,61
5 96 --- 120 0,80
6 96 --- 360 0,80
7 96 --- 600 0,80
152
но [9] по крайней мере 5 таких форм. Вопрос о природе множественных форм
НАД-киназы из проростков гороха остался открытым. Отсутствуют какие-либо
сведения о молекулярном весе этих ¦форм. Нельзя исключить, однако,
возможности того, что добавление кальмодулина к неактивному или частично
сохранившему .активность ферменту могло бы наряду с активацией привести к
изменению степени ассоциации белка.
Как было уже сказано, фермент из печени кролика, в отличие >от
фермента из сердца голубя, сохраняет четвертичную структуру после
ионообменной хроматографии, однако получаемые олигомеры утрачивают
способность к взаимным переходам. Послед-лее обстоятельство позволило
определить удельную активность каждого из выделяемых в электрофоретически
гомогенном состоянии олигомеров и показать, что олигомеры разной степени
ассоциации проявляют различную каталитическую активность.
Определяя в растворе активность того или иного фермента, обладающего
четвертичной структурой, экспериментатор часто ие имеет возможности
составить представление о том, как изменяется и меняется ли вообще эта
структура в процессе каталитического акта. Такой вопрос просто не
возникает, если кинетическое доведение ферментов не обнаруживает
отклонений от простых кинетических закономеростей типа гиперболического
закона Миха-элиса-Ментен.
Отсутствие зависимости а от [Е]" для гомогенных препаратов НАД-киназы
