Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
обусловлено утратой гомогенными формами фермента способности к ассоциации
или диссоциации, несмотря на то, что НАД-киназа из печени кролика, в
отличие от фермента из сердца голубя, сохраняет четвертичную структуру
после ионообменной хроматографии. Как было отмечено выше, при изучении
зависимости а от [Е]0 для частично очищенных ферментов из скелетных мышц
кролика и сердца голубя не представлялось возможным оценить вклад каждой
из форм в удельную активность препарата вследствие легкого взаимного
перехода в разной степени ассоциированных олигомеров. В случае НАД-киназы
из печени кролика удалось определить удельную активность отдельных
олигомеров, получаемых после фракционирования на ионообменнике, в силу
того, что они утратили способность к ассоциации - диссоциации. Из данных
таблицы 1 следует, что олигомеры a-типа НАД-киназы с молекулярным весом
280000-290000, 180000-190 000 и 150 000-160000 демонстрируют удельную
активность 20-30, 10-20 и 3,6 ед./мг соответственно. Для олигомеров p-
типа фермента с молекулярным весом 280000-290000 и 210 000-220000
удельная активность выражается величинами 130 и 160 ед./мг
соответственно. Полученные результаты подтверждают высказанное на
основании зависимости а от [Е]о предположение о различной каталитической
активности множественных молекулярных форм НАД-киназы.
Молекулярная гетерогенность НАД-киназы и различная каталитическая
активность олигомеров находят свое выражение в сложном кинетическом
поведении фермента. На кривой зависимости v от [S]" для фермента из
скелетных мышц кролика проявляются перегибы и промежуточный максимум
(рис. 3 А, кривая /). Форма таких кривых варьирует при изменении pH
инкубационной среды и зависит от длительности хранения ферментного
препарата и концентрации фермента. НАД-киназа из скелетных мышц кролика
имеет несколько оптимумов pH [23].
Следует заметить, что при значительном повышении концентрации белка в
пробе (рис. 3 Л, кривая 2) сложная кривая зависимости v от [S].
значительно упрощается и представляет собой гиперболу. Выражение той же
зависимости в обратных координатах дает возможность рассчитать значение
/С^АД1, равное
0,67-10"3 М.
Упрощение сложной кинетической кривой v от [НАД] до ги-
144
перболы наблюдали и при внесении в среду инкубации цАМФ в конечной
концентрации 10-5 М [4]. Возможно, что цАМФ, как и повышение концентрации
белка, способствует ассоциации олигомеров.
Рис. 3. Зависимость скорости синтеза НАДФ от концентрации НАД. А - апД-
кииаза из скелетных мышц кролика: 1 - концентрация фермента в
инкубационной пробе 56 мкг/мл; 2- концентрация фермента в инкубационной
пробе-2214 мкг/мл; Б - НАД-киназа из сердца голубя: 1 - частично
очищенный фер-, '* мент; 2 - гомогенный фермент
Частично очищенные препараты НАД-киназы из сердца голубя по
кинетическим параметрам во многом напоминают свойства фермента из
скелетных мышц. Зависимость скорости синтеза НАДФ от концентрации НАД
таких препаратов описывается, как и в случае НАД-киназы из скелетных
мышц, сложными по форме кривыми, имеющими промежуточный максимум и плато
(рис. 3 Бу кривая 1). Поскольку исследуемые препараты фермента из сердца
голубя всегда содержат несколько олигомерных форм, сложную кинетическую
кривую можно рассматривать как сумму кинетических кривых, характеризующих
отдельные олигомеры [7, 24].
Отмечено изменение формы кривой v от [НАД] при добавлении в инкубационную
среду разных количеств белка препарата НАД-киназы. Десятикратное
увеличение содержания фермента в пробе-(с 47 мкг до 470 мг)
сопровождается некоторым упрощением кинетической кривой, однако она не
превращается в гиперболу, как это имело место в случае НАД-киназы из
скелетных мышц кролика.
С целью проверки специфичности эффекта повышения концентрации
фермента на его удельную активность в реакционные-пробы, содержавшие
препарат фермента, добавляли четырехкратный избыток сывороточного
альбумина быка. Альбумин существенно не влиял ни на удельную активность
фермента, ни на форду кинетической кривой.
Выше было показано, что НАД-киназа из сердца голубя после-
145.
счистки до гомогенного состояния утрачивает способность к олигомеризации.
Изменение четвертичной структуры находит свое отражение и в кинетических
свойствах фермента (рис. 3 Б, кривая 2). Удельная активность таких
препаратов не зависит от (Концентрации фермента в среде инкубации, а
зависимость v от IS]. описывается гиперболой. таких
препаратов равна
¦0,1 мМ.
Наблюдаемые различия в кинетических свойствах частично ¦очищенных и
электрофоретически гомогенных препаратов, по-видимому, сопряжены с
утратой ферментом при очистке до гомогенного состояния присущих ему
свойств диссоциирующей ферментной системы. .
,
Очистка сопровождается разрушением четвертичной структуры, гомогенный
фермент из сердца голубя представлен мономером, не способным к ассоциации
