Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
множественных молекулярных форм (ММФ) ферментов, в частности
диссоциирующих ферментов, способных к обратимой диссоциации - ассоциации.
Наличие ММФ в клетке является одним из тех инструментов, 9 помощью
которых в организме обеспечивается быстрая, тонкая и, точная регуляция
активности ферментов.
*¦ Среди ферментов каталитического аппарата клетки важное место
принадлежит НАД-киназе (КФ.2.7.1.23), синтезирующей НАДФ из НАД и АТФ.
НАДФ в окисленной и восстановленной формах участвует во многих процессах
обмена веществ и энергии: свыше 150 ф(ерментов используют НАДФ(Н) в
качестве субстрата или кофактора. Для НАД-киназы из ряда источников
показана возможность существования более чем в одной молекулярной форме
[2-14]. \
Относительно природы обнаруженных множественных форм в литературе нет
единой точки зрения. Полагают, что ММФ НАД-киназы, обнаруженные в
гиалоплазме и митохондриях дрожжей [Н]> у Triatoma infestans при
интоксикации ДДТ [8], в частично очищенных препаратах из проростков
гороха [9], являются изозимами. Можно думать, что ММФ фермента из
наружных сегментов глаза быка [14] н из Azotobacter vinelandii [15]
представлены конформерами, тогда как НАД-киназа из скелетных мышц кролика
[2-4], сердца голубя [5, 7] и печени кролика [6] представляет собой
диссоциирующую ферментную систему,
"36
состоящую из олигомеров разной степени ассоциации, обладающих различной
каталитической активностью.
В настоящем обзоре- предпринята попытка обобщить результаты,
полученные главным образом при изучении свойств НАД-ки-наз из трех
последних источников: скелетных мышц кролика,
сердца голубя и печени кролика. Основное внимание будет уделено
рассмотрению тех изменений в четвертичной структуре фермента, которые
происходят в процессе его очистки до гомогенного состояния, и выяснению
возможных причин, лежащих в основе наблюдаемой при этом частичной или
полной утраты очищенным ферментом регуляторных свойств.
Четвертичная структура НАД-киназы
; #
Для изучения четвертичной структуры НАД-киназы из скелетных мышц кролика
использовали препараты фермента, очищенные в 150-300 раз. Тремя
независимыми методами: электрофорезом в однородном геле и в градиенте
концентрации полиакриламидного геля, путем разделения в тонком слое
сефадекса G-200, с по* мощью гель-фильтрации через колонку с сефадексом
G-200 - была обнаружена большая гетерогенность препарата в отношении НАД-
киназы [2, 4]. Локализацию фермента в геле определяли по измерению
активности в элюатах, полученных после разрезания столбика геля на диски
толщиной 2 мм. При это оказалось, что по данным диск-электрофореза в
однородном геле ферментативной активностью обладают четыре зоны,
характеризующиеся значениями Rf 0,1, 0,52, 0,73 и 0,98. Повторный
электрофорез белка с электрофоретической подвижностью, близкой к 1,0,
после его элюции и кондентрирования обнаружил несколько белков с более
низким, чем у исходного, значением Rf (0,73, 0,52, 0,07).
Пять белковых зон, проявляющих ферментативную активность, были
выявлены с помощью метода тонкослойной гель-фильтрации через сефадекс G-
200. Значения "молекулярных весов обнаруженных форм фермента колебались в
пределах от 40000-45000 до 280 000-300000. Было показано, что каждая из
пяти полученных в результате гель-фильтрации фракций при последующем
диск-электрофорезе разделяется на несколько белковых зон, среди которых
преобладают зоны с одинаковой электрофоретической по--движностью: 0,52,
0,73 и 0,98. Формы с более низким значением Rf обнаружены во фракциях,
содержащих высокополимерные белки. Полученные при электрофоретическом
анализе и гель-фильтрации экспериментальные данные свидетельствуют о
присутствии в препаратах НАД-киназы нескольких форм фермента. Показана
возможность перехода одних форм в другие. Иными словами, исследованные
препараты фермента содержат равновесную систему множественных
молекулярных форм, различающихся по молекулярному весу и способных
осуществлять взаимные переходы. В процессе гель-фильтрации эти формы
разделяются по молекулярному весу, а последующие процедуры элюции и
концентриро-
137
вания белка перед электрофоретическим анализом и в процессе самого
электрофореза создают условия для перехода одних форм в другие.
Присутствие ММФ в препаратах НАД-киназы из скелетных мышц кролика было
продемонстрировано также при фракционировании на колонке с сефадексом G-
200 (3), а значения молекулярных весов олигомеров фермента были уточнены
с помощью метода электрофореза в линейном градиенте концентрации
полиакриламидного геля (ПААГ) [16]. Результаты, полученные при
исследовании фермента двумя указанными методами, показали, что в частично
очищенных препаратах НАД-киназы присутствуют олигомеры фермента с
молекулярными весами 31000, 65000, 94 000, 160 000, 220 000, 350 000.
Наименее ассоциированной формой НАД-киназы является белок с молекулярным
