Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
весом 31 000, который, по-видимому, можно считать субъединицей фермента
на том основании, что после обработки додецилсульфатом натрия двух
низкомолекулярных фракций, снятых с колонки (31 000,
65 000), и последующего электрофореза на электрофореграммах не был
обнаружен белок с молекулярным весом, меньшим 30 000.
Проведенное исследование четвертичной структуры НАД-киназы из
скелетных мышц кролика указывало на присутствие в препарате фермента
равновесной системы диссоциирующих олигомеров, состоящих из различных
сочетаний субъединиц с молекулярным весом равным 31 000.
При изучении свойств НАД-киназы из скелетных мышц использовали
высокоочищенные, но ие гомогенные препараты НАД-киназы. Препарат фермента
из сердца голубя был электро-форетически получен в гомогенном состоянии.
Метод выделения и очистки в качестве последних стадий включал
ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе А-50 и гель-фильтрацию на
сефарозе 6В [5]. Сравнение свойств частично очищенных и гомогенных, по
данным электрофореза, препаратов фермента позволило установить следующую
закономерность. Частично очищенные ферментные препараты НАД-киназы из
сердца голубя подобно ферменту из скелетных мышц кролика гетероген'ны и
представлены не менее чем пятью молекулярными формами, число которых
могло варьировать от препарата к препарату: НАД-киназную активность
проявляли формы с молекулярными весами, равными 300 000-270 000, 230 000-
200 000, 180 000, 120 000 и 45 000. Из распределения общей активности
фермента между различными молекулярными формами следует, что большая
часть НАД-киназы представлена олигомерами с молекулярным весом 180000.
Присутствие ММФ в частично очищенных препаратах НАД-киназы из сердца
голубя' было продемонстрировано также методом гель-фильтрации на колонках
с сефадексом G-200. На рис. 1 представлены профили элюции двух препаратов
НАД-кина-зы. Можно видеть, что в процессе гель-фильтрации с колонки
сходит один асимметричный пик белка. Активностью обладают фракции с
молекулярными весами 270000-240 000, 230000-210000,
Ш
НММЬ/Ч-М/!
180000 и 85 000-90 000. Сравнение кривых элюирования двух препаратов НАД-
киназы показало различия в количественном соотношении между олигомерами с
высоким и низким молекулярными весами. В препарате I на долю олигомера с
молекулярным весом 90000 приходится до половины общей ферментативной
активности, тогда как препарат II содержит преимущественно
высокоассоциированные формы фермента.
Значения молекулярных весов разных форм НАД-киназы, определенные
методом гель*фильтрации, совпадают с величинами, определенными методом
электрофореза в градиенте концентрации ПААГ, за исключением
низкомолекулярной формы НАД-киназы с молекулярным весом 45000, которую
при гель-фильтрации обнаружить не удавалось.
Однако при анализе сошедшей с колонки фракции НАД-киназы, имеющей
молекулярный вес 90000, методом электрофореза в градиенте концентрации
ПААГ было показано наличие в ней, помимо белка с исходным молекулярным
весом 90000, еще двух с молекулярными весами 45000 и 180000. Эти данные
указывают на возможность перехода одних молекулярных форм в другие.
Смещением равновесия между олигомерными формами киназы можно объяснить
санные' выше различия филях элюции фермента ных препаратах.
Результаты, полученные при электрофоретическом исследовании и гель-
фильтрации НАД-киназы из сердца голубя, указывают на то, что частично
очищенные препараты фермента, как и в случае НАД-киназы из скелетных мышц
кролика, содержат несколько белковых фракций, различающихся по
молекулярному весу и проявляющих каталитическую активность, которые можно
рассматривать как в разной степени ассоциированные олигомеры фермента.
В противоположность частично очищенному препарату гомогенная по
данным электрофореза НАД-киназа из сердца голубя утрачивает способность к
ассоциации - диссоциации. При гель* фильтрации такого "препарата через
колонку с сефарозой 6В НАД-
Рис. 1. Кривая элюирования белка и выход НАД-киназы при гель-фильтрации
через колонку с сефадексом G-200 двух ферментных препаратов (I и II) из
сердца голубя.
По оси абсцисс - объем выхода фракций, по оси ординат: левая шкала -
Агво, правая - активность; стрелками указан молекулярный вес фракций;
сплошная линия - белок, прерывистая - активность
13"
киназа элюируется в виде одной фракции с молекулярным весом 45 000.
Высокомолекулярные формы исчезают, в том числе и форма с молекулярным
весом 180000, которая нередко преобладала в частично очищенных препаратах
фермента (см. рис. 1).
При электрофорезе в однородном геле очищенный фермент давал одну
полосу, что указывало на его гомогенность. Молекулярный вес субъединицы,
определенный в присутствии додецил-сульфата натрия, оказался также равным
45 000. Эти данные свидетельствуют о том, что в процессе ионообменной
хроматографии разрушается четвертичная структура фермента, и в разной
степени ассоциированные олигомеры распадаются на субъединицы.
