Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
В частично очищенных препаратах НАД-киназы из печени кролика также
обнаружено несколько молекулярных форм фермента [6]. Электрофоретическое
разделение в однородном и градиентном гелях с последующим выявлением
места локализации НАД-киназы тетразолиевым .методом и элюцией фермента из
отдельных участков столбика геля позволило выявить до 7 полос белка,
проявляющих ферментативную активность. Молекулярные веса этих белковых
зон оказались равными 650000, 400 000,
380 000-370 000, 300000-280000, 230000-210 000, 200000,
180000. В определенных условиях удавалось наблюдать переходы между
формами.
При выделении НАД-киназы из печени кролика в качестве последней стадии
очистки использовали также ионообменную хроматографию на ДЭАЭ сефадексе
А-25. В отличие от НАД-киназы из сердца голубя, которая после
ионообменной хроматографии утрачивала четвертичную структуру и была
представлена только одной формой - мономером, фракционирование на ионооб-
меннике НАД-киназы из печени кролика не сопровождалось разрушением
четвертичной структуры. На этой стадии очистки было получено несколько
электрофоретически гомогенных олигомеров с молекулярными весами 280 000--
290 000, 180000 и 150 000- 160000, 210000-220000 [17]. Как правило, все
препараты фермента содержали форму с молекулярным весом 180 000-190000.
Число форм в разных препаратах, получаемых после ионообменной
хроматографии, могло варьировать. Никогда не наблюдали присутствия всех
форм в одном препарате одновременно. Всего было исследовано 40 препаратов
НАД-киназы.
На основании анализа гомогенных препаратов фермента было сделано
заключение о существовании в печени кролика двух типов НАД-киназы:
относительно низкоактивного фермента, в формировании четвертичной
структуры которого участвуют однородные субъединицы с Мг 33 000 (a-тип),
и высокоактивного фермента, олигомеры которого построены из субъединиц с
Мг 62 000 (p-тип). Каждый из* указанных типов фермента может существовать
в виде олигомерных форм разной степени ассоциации. В таблице 1
представлены результаты, полученные при определении молекулярных весов и
удельной активности а- и p-типов НАД-киназы из печени кролика. Фермент a-
типа постоянно присутствует
140
Таблица 1
Молекулярный вес н удельная активность олигомеров НАД-кииазы а- и
Р-типов (17)*
Форма (Мг) Удельная актив Тнп Молекулярный Количество
ность, ед./мг субъединиц вес субъединиц препаратов,
содержащих
данную форму
280 000---290 000 130 Р 62 000 4
280 000---290 000 20---30 а 33000 7
210 000---220 000 160 Р 62 000 И
180000---190 000 10---20 а 33000 40
150 000---160 000 3---6 а 33000 16
в печени кролика, тогда как фермент p-типа обнаруживается нь в каждом
препарате (в 15 из 40 препаратов). В процентном отношении доля
высокоактивных форм фермента по белку меньше, а ло активности больше, чем
доля малоактивных форм. Так, в разных препаратах на долю p-формы НАД-
киназы приходится от
66 до 80% общей активности и всего 15-20% ферментного белка, тогда как в
случае а-НАД-киназы наблюдается обратное соотношение: на ее долю
приходится 15-20% общей активности и 60- .70% белка ферментного
препарата.
Выше было указано, что молекулярный вес субъединицы НАД-киназы из
скелетных мышц кролика равен 31 000. Близкие по значению Мг су.бъединицы
определены для фермента из печени крысы (35 000) и голубя (34 000), а
также из дрожжей Saccharo-myces cerevisiae (31000) и Candida utilis (32
000) [18, 19, 20, 10].
Основываясь на близких значениях молекулярных весов субъединицы а-
НАД-киназы и фермента из вышеуказанных объектов, можно считать, что
фермент a-типа из печени кролика подобен ¦ферментам из других источников.
Что касается р-НАД-киназы, то этот тип фермента обнаружен пока только в
печени кролика.
Сравнительное изучение а- и p-типов НАД-киназы из печени кролика
показало, что эти два типа фермента различаются по тиногим свойствам.
Помимо описанных выше различий в субъеди-ничном составе и удельной
активности можно указать на разный характер взаимодействия двух типов
фермента с ионообменником, на некоторые различия кинетических свойств и
др.
Несмотря на то что из печени кролика можно выделить пять гомогенных
форм фермента, а из сердца голубя только одну, общим свойством для
фермента из обоих источников является то, что его гомогенные молекулярные
формы не способны к ассоциации или диссоциации и представляют собой как
бы застывшие, десенсибилизированные формы.
Весь изложенный выше материал убедительно свидетельствует о
существовании НАД-киназ в скелетных мышцах кролика, сердце голубя и
