Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
ассоциации - диссоциации, и независимо от условий гель-фильтрации
молекулярный вес его остается неизменным и равным 43000. При этом •было
замечено, что в процессе ионообменной хроматографии с колонки смывается
фракция, содержащая низкомолекулярный, термостабильный фактор, при
добавлении которого к очищенному ¦ферменту с молекулярным весом 43000
последний вновь приобретает утраченную способность образовывать более
высокомолеку-
149
лярные формы. Фактор прочно сорбировался на колонке, и элюировался при
более высоком значении ионной силы раствора, чем фермент.
При анализе белковых фракций, смываемых с колонки при ионообменной
хроматографии НАД-киназы из печени кролика, был обнаружен фактор,
способный изменять активность фермента. Этот фактор не связывается с
ионообменником и выходит при нанесении образца фермента на колонку в
первой белковой фракции. Вопрос о том, какова его природа и не является
ли он кальмодулином, будет рассмотрен ниже. Фактор не обладает
ферментативной активностью, термостабилен (его эффект сохраняется после
прогревания в течение 5-7 мин при 10(Г€), не проходит через мембрану при
диализе или ультрафильтрации. При исследовании действия фактора на НАД-
киназу из печени кролика мы не всегда наблюдали однозначный эффект, что
выражалось в следующем. Во-первых, степень активации варьировала в
широких пределах (от 30 до 150%). а при большом избытке фактора наблюдали
даже десятикратную активацию. Причина неодинаковой активации, по-
видимому, кроется в различном содержании самого активатора в разных
частично очищенных препаратах, используемых в опыте. Во-вторых, фактор
оказывал влияние не на все препараты фермента. Степень активации зависела
также от типа НАД-киназы (а или р). Было выяснено, что более выражено
активирующее действие фактора на a-форму НАД-киназы [17]* При этом из
двух форм фермента a-типа с молекулярным весом 150 000 и 180000 в большей
степени активируется первая, наименее активная форма. На первый взгляд
эти данные трудно объяснить действием одного активатора. Для
интерпретации получен* ных результатов проще всего было бы допустить
присутствие в использованных частично очищенных препаратах, помимо
активатора, еще и ингибитора фермента. Для многих ферментов показана
возможность регуляции каталитической активности при участии как
активатора, так и ингибитора. Очевидно, что конечный эффект будет
зависеть только от соотношения активатор/ин-. гибитор в используемых
препаратах. Активация может наблюдаться, когда действие активатора
преобладает над действием ингибитора. В противном случае выявляется
ингибирование фермента. Эффект отсутствует, когда действие активатора
уравнобе-шивается действием ингибитора.
Мы придерживаемся иной точки зрения при объяснении полученных
результатов и исходим из того, что между ферментом и регулятором в
зависимости от концентрационных соотношений могут образовываться
различающиеся по стехиометрии комплексы с разной каталитической
активностью. Высказанная точка зрения нашла экспериментальное
подтверждение. Как следует из; данных, представленных на рис. 4, можно
наблюдать оба эффекта - активацию и ингибирование, добавляя разные
количества частично очищенного препарата регулятора к одному и тому же
количеству фермента.
150
Особое внимание следует обратить на тот факт, что обнаруженный
регулятор активности при добавлении к гомогенному ¦ферменту возвращает
НАД-киназе утраченное ею свойство, характерное для диссоциирующей
ферментной системы, а именно .зависимость удельной активности от
концентрации фермента (см. рис. 2 В, 2). Как можно видеть, действие
фактора специфическое, так как добавление сывороточного альбумина быка к
очищенному ферменту в тех же концентрациях не оказывает влияния на
активность фермента при изменении концентрации последнего в инкубационной
среде (рис. 2 В, 3).
Рис. 4. Кривая титрования НАД-киназы из. печени кролика регулятором.
По оси ординат - активность, %
(за 100% принята активность пробы без добавления регулятора), по оси
абсцисс - количество добавленного регулятора в икг белка частично
очищенного препарата, мкг.
Фермент: fi-форма НАД-киназы,
Мг 210 ООО, добавлен в количестве 5 мкг иа пробу
В настоящее время мы не располагаем прямыми данными относительно
изменения четвертичной структуры НАД-киназы из печени при добавлении
активатора к гомогенному ферменту. Однако тот факт, что в присутствии
активатора очищенный фермент вновь демонстрирует зависимость удельной
активности от концентрации белка в среде инкубации, дает основание
предположить, что фактор, отделяемый от фермента при ионообменной
хроматографии, может способствовать, как и в случае 3-фосфо-
глицераткиназы, переходу фермента из одного олигомерного состояния в
другое.
В сердце голубя также был обнаружен фактор, способный активировать
НАД-киназу. В качестве источника активатора использовали надосадочную
жидкость, остающуюся после осаждения комплекса НАД-киназы с
