Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 6
Маркерные гены и гены-репортеры, используемые в современной генной инженерии микроводорослей [189]
Ген
Белковый продукт, функция
Источник гена
Применение
AphVIII Аминогликозид-З'-фосфо-
трансфераза (устойчивость к паромомицину, канами-цину и неомицину)
В1е Белок устойчивости к блео-
мицину (устойчивость к таллизомицину и родственным антибиотикам) Nptll Неомицинфосфотрансфера
за II (устойчивость к G418) Als Ацетолактатсинтаза
(устойчивость к гербицидам, производным сульфа-нилмочевины)
Сгу1-1 Рибосомный белок S14
Оее-1 Белок-энхансер выделения
кислорода (oxygen evolving enhancer protein)
Cat Хлорамфениколацетил-
трансфераза (устойчивость к хлорамфениколу)
Hpt Гигромицин В-фосфотранс-
фераза
AadA Аденилилтрансфераза
(устойчивость к спектино-мицину)
Nat Устойчивость к ноурсео-
трицину Sat-1 То же
EGFP Модифицированный зеле-
ный флуоресцирующий белок
ChGFP То же
Streptomyces
rimosus
Streptoalloteichus
hindustanus
Транспозон Tn5 Е. coli
Chlamydomonas
То же То же
Транспозон Тп9
Е. coli Эубактерии
Streptomyces
noursei
Е. coli
Искусственный (оптимизированный по использованию кодонов) То же
М
М
М
М
М
М
М
М
М
М
М
Р
Таблица 6 (окончание)
Ген Белковый продукт, функция Источник гена Применение
Gus Р-Гл юкуронидаза Е. coli P
Glutl Переносчик глюкозы Человек M или P
Hupl Переносчик гексоз Chlorella kessler M или P
E-frustulin Кальций-связывающий Navicula P
гликопротеин pelliculosa
Ars Арилсульфатаза Chlamydomonas P
Luc Люцифераза Horatia parvula P
Примечание. M - маркерный ген, P - ген-репортер.
ет голубую окраску, а ткани, экспрессирующие трансген, приобретают соответствующий цвет. В процессе метаболизма MUG с участием гена-репортера освобождается флуоресцирующее соединение. При этом количественное определение флуоресценции позволяет охарактеризовать уровень экспрессии гена gus, а следовательно, и само трансгенное растение с точки зрения экспрессируемости трансгена. В последнее время все большую популярность приобретает использование в качестве репортера гена зеленого флуоресцирующего белка (GFP) [188]. Дополнительные сведения о маркерных генах и генах-репорте-рах, применяемых в современной генной инженерии растений, можно найти в табл. 6.
Два типа векторных систем, используемых для трансформации клеток растений. На основании способа доставки трансгенов в клетки различают два типа векторных систем. В одной из них осуществляют так называемое прямое введение трансгена в клетки или протопласты, лишенные клеточной стенки, однодольных и двудольных растений с использованием группы стандартных методов, включающих Са2+-зависимую трансформацию в присутствии полиэтиленгликоля, электропорацию, бомбардировку клеток микрочастицами, нагруженными ДНК, и т.п. (см. разделы 3.8.3. и 3.8.4.). Эта группа подходов к трансформации клеток растений известна также под названием “перенос генов, опосредованный ДНК” (DNA-mediated gene transfer - DMGT). Системы второго типа основаны на применении ферментативного аппарата доставки ДНК бактерий Agrobacterium tumefaciens или A. rhizogenes, которые обладают способностью трансформировать клетки растений в природных условиях.
Векторы для прямой трансформации клеток. Специфика векторов этого типа обусловлена, главным образом, регуля-
хорными последовательностями нуклеотидов, которые обеспечивают эффективную транскрипцию генов в растительных тканях. Например, в известном векторе pCaMVCAT используются промотор и сайт полиаденилирования гена 5S РНК вируса мозаики цветной капусты, под контролем которых находится ген бактериальной хлорамфениколацетилтрансферазы (cat) [190]. Этот ген-репортер применяется для оптимизации условий введения векторной ДНК в клетки растений (поскольку имеются очень чувствительные методы обнаружения активности этого фермента) и может быть заменен на любой другой ген. Вектор pCaMVCAT является челночным, т.е. может реплицироваться как в клетках Е. coli, так и растений. В первом случае селектируемым маркером служит, как обычно, ген устойчивости к ампициллину. Векторы этого типа с нерегулируемым промотором используются с целью получения временной экспрессии рекомбинантных генов и проведения фундаментальных исследований функциональной организации генома растений. При конструировании векторов для постоянной экспрессии генов в клетках растений ген cat обычно заменяют на доминантный селектируемый маркер, например, ген устойчивости к канамицину [189].
Векторы на основе Ti-плазмид. Бактерию Agrobacterium tumefaciens иногда называют природным генным инженером за ее способность переносить свою ДНК в клетки зараженных растений, интегрировать ее в геном организма-хозяина и вызывать стабильную трансформацию этих клеток введенными генами, т.е. индуцировать рост опухолей. Вирулентные штаммы агробактерий содержат Ti-плазмиды, размер которых составляет 200-250 т.п.о. Во время инфекции определенная последовательность Ti-плазмиды, получившая название Т-ДНК (transferred), переносится в клетки и случайным образом интегрируется в геном и ее гены экспрессируются в зараженных клетках. Т-ДНК содержит гены, обеспечивающие биосинтез фитогормонов ауксина и цитокинина, которые, в свою очередь, приводят к независимой от гормонов пролиферации клеток и росту опухолей. Т-Область плазмиды не содержит генов, которые обеспечивают их мобилизацию, а соответствующие функции выполняют ~20 генов Vir-области плазмиды, организованных в опе-рон. Экспрессия генов vir индуцируется в условиях, имитирующих таковые сока растений, т.е. при низких значениях pH и в присутствии специфических фенольных соединений типа предшественника лигнина и продуктов его деградации. Индукция опосредована рецептором этих соединений VirA и активатором
