Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Введение рекомбинантных ДНК в составе векторных молекул в хлоропласты высших растений в основном осуществляют биолистическими (biolistic) методами путем бомбардировки клеток микрочастицами с сорбированными на них молекулами ДНК [199]. Принцип таких методов будет кратко рассмотрен в разделе 3.8.3. По-прежнему весьма популярным остается метод трансформации хлоропластов с использованием полиэтилен-гликоля [200].
3.8. Введение рекомбинантных ДНК в клетки
После завершения лигирования векторных молекул с клонируемыми фрагментами ДНК образовавшиеся рекомбинантные молекулы необходимо вводить в подходящие клетки, где бы они могли длительное время существовать и стабильно передаваться дочерним клеткам в процессе клеточных делений. По способу введения рекомбинантных ДНК в клетки все существующие методы разделяют на четыре большие группы: биологические, химические, физические и механические. Биологические методы основываются на переносе генов в процессе вирусной инфекции и использовании клеточных рецепторов для захвата чужеродной ДНК, в том числе и бактериальными клетками с природной компетентностью. Группа химических методов включает в себя использование ионов металлов (Са2+, Rb+), ДЭАЭ-декстрана, липо-
сом (липофекция) и т.п. химических реагентов. В соответствии со своим названием в физических методах применяют электрические поля высокой напряженности (электропорация), а также лазерное излучение для создания пор в мембранах клеток-реципиентов рекомбинантных ДНК. Наконец, при механическом введении ДНК имеет место грубое нарушение целостности мембран клеток, например, при микроинъекции или бомбардировке клеток микрочастицами, на которых сорбированы рекомбинантные молекулы.
Наиболее часто используемый в генно-инженерных исследованиях процесс поглощения экзогенной ДНК бактериальными клетками, сопровождающийся приобретением ими новых генетических маркеров, называют генетической трансформацией [201]. В том случае, если бактериальные клетки захватывают ДНК бактериофагов и в результате происходит образование зрелых фаговых частиц, говорят о трансфекции фаговой ДНК. Поглощение экзогенной ДНК в процессе трансформации и трансфекции может осуществляться лишь компетентными клетками. Под компетентностью понимается такое состояние бактериальных клеток, при котором они способны сорбировать экзогенную ДНК на своей поверхности и поглощать ее, после чего экзогенная ДНК может быть интегрирована в бактериальную хромосому или существовать в виде внехромосомного элемента (эписомы, плазмиды).
3.8.1. Природная компетентность бактериальных клеток
Для многих грамположительных бактерий компетентность является естественным свойством, которое становится максимально выраженным на определенных этапах роста культуры. В природных условиях данный процесс является одним из проявлений коллективного поведения микроорганизмов в популяции, сопровождающегося саморегулированием ее численности и синхронным изменением характера экспрессии генов в отдельных клетках [202, 203]. В то же время, у наиболее важных Для генной инженерии грамотрицательных клеток Е. coli естественная компетентность вообще отсутствует и клетки приобретают ее лишь в искусственных условиях. За исключением Neisseria и родственных им бактерий, для которых характерна непрерывная компетентность, остальные часто используемые бактерии, обладающие природной компетентностью, генетически регулируют ее регулоном компетентности. Компетентность для таких бактерий является нормальной физиологиче-
ской стадией развития. Грамположительные бактерии регулируют свою компетентность секретируемыми внешними факторами компетентности или фермонами (phermones), а также экспрессией определенных генов, которая сопровождается синтезом внутренних и внешних белков, участвующих в развитии компетентности. Грамотрицательные бактерии такие, как Haemophilus influenzae, контролируют компетентность преимущественно внутренними механизмами.
Биологический смысл природной компетентности бактерий не вполне понятен. Процесс трансформации бактериальных клеток в природных условиях обеспечивает поддержание жизненно важного динамического состояния генома бактериальных клеток. Развитие компетентности тесно сопряжено с рекомбинацией и репарацией бактериальных хромосом и является одним из молекулярных механизмов, обеспечивающих горизонтальный перенос генов у микроорганизмов [204]. В настоящее время имеются указания на то, что донорная ДНК, которая захватывается бактериальными клетками в природных популяциях микроорганизмов, появляется не только из-за случайной гибели клеток. Развитие компетентности, по крайней мере у Streptococcus pneumoniae, индуцирует лизис части клеток этой популяции и освобождение геномной ДНК, а следовательно, процессы освобождения ДНК и ее захвата бактериальными клетками в таких системах координированы [205]. Суммируя данные о биологическом значении природной компетентности бактериальных клеток, можно заключить, что при участии этого процесса происходит обмен генетической информацией в популяциях микроорганизмов, что необходимо для поддержания генетического разнообразия вида и распространения генов, важных для выживания бактерий в изменяющихся условиях окружающей среды. Кроме того, трансформирующая ДНК может участвовать в репарации повреждений бактериальных хромосом после генотоксических воздействий [206].
