Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
ся энхансером CMV (рис. 14, а). Вектор содержит сайт полиаде-нилирования (З-глобинового гена кроликов. В РНК, синтезируемую с этих промоторов, включается последовательность интро-на, что необходимо для правильного процессинга и экспорта РНК. Вектор обладает также промотором Т71ас (гибридный промотор, содержащий последовательность /ас-оператора, что обеспечивает дополнительный контроль транскрипции) терминатором Т7-РНК-полимеразы для осуществления при необходимости транскрипции клонированного гена в бактериальных клетках и промотором р10 бакуловирусов, который обеспечивает высокий уровень экспрессии гена в клетках насекомых, зараженных баку-ловирусами (см. раздел 6.2.5). Сигналы инициации трансляции вектора включают сайт связывания бактериальных рибосом, вслед за которым расположена консенсусная последовательность, обеспечивающая инициацию трансляции в клетках млекопитающих. Следует отметить наличие в обоих концах полилинкера сайтов для рестриктаз, расщепляющих ДНК с образованием тупых концов, которые позволяют при необходимости клонировать в любой из трех возможных рамок считывания ген устойчивости к ампициллину в качестве селектируемого маркера, области начала репликации плазмид семейства pUC, а также маркерную последовательность, кодирующую пептид His6_10 для очи-
стки рекомбинантного белка на никелевой колонке. Кроме того, по этим сайтам можно вводить маркерную последовательность (например, кодирующую стандартно используемую в качестве метки последовательность GlnProGluLeuAlaProGluAspProGluAsp вируса простого герпеса), обеспечивающую обнаружение рекомбинантного белка с помощью моноклональных антител, а также последовательности, кодирующие сайты действия протеолитиче-ских ферментов для удаления вышеупомянутых маркерных последовательностей из рекомбинантных белков.
Для получения стабильной экспрессии рекомбинантных генов в клетках животных можно использовать другую разновидность вектора рТпЕх (рис. 14, б). Принцип функционирования такого вектора заключается в том, что рекомбинантный белок экспрессируется в виде гибридной молекулы, С-концевая часть которой содержит маркерный полипептид (неомицин- или гигроми-цин В-фосфотрансферазу), обеспечивающий клеткам устойчивость к антибиотикам неомицину или гигромицину, соответственно. В таких системах клетки, устойчивые к антибиотику, гарантированно экспрессируют и рекомбинантный белок, что легко контролируется путем выращивания клеток на соответствующих селективных питательных средах. Трансляцию гибридной мРНК обеспечивает кэп-независимый энхансер трансляции CITE (cap-independent translation enhancer) вируса энцефаломиокардита (EMCV) или внутренний сайт связывания рибосом IRES (internal ribosome entry site).
3.7.2. Векторы растений
Необходимость и последствия использования векторов растений. Разработка методов введения новых или измененных генов в геном растений [185] позволяет получать трансгенные генетически модифицированные (genetic modified - GM) растения, эффективно экспрессирующие эти гены, что привело к зеленой революции в сельском хозяйстве, которая и сегодня далека от своего завершения. Значительная часть сельскохозяйственных угодий, особенно в США, занята генетически измененными растениями, в частности, хлопком, кукурузой и соей. Для большинства генетически модифицированных растений характерна высокая урожайность, что достигается, в том числе, приданием растениям устойчивости к насекомым и гербицидам. Введение трансгенов позволяет повышать качественные характеристики трансгенных растений. Например, методами генной инженерии удается изменять форму и расцветку цветов, а также увеличивать про-
должительность сохранения ими товарного вида в срезанном состоянии. Созданы сорта картофеля со сбалансированным содержанием крахмала в клубнях, а также сорта риса, содержащие в зернах провитамин А, что позволяет избегать авитаминоза при преимущественном использовании риса для питания. На основе трансгенных растений получены эффективные вакцины, реализующие свое действие после использования таких растений в пищу. Воплощение в жизнь масштабных проектов, связанных с генетически модифицированными растениями, потребовала разработки новых векторных систем, а также методов введения векторов в клетки растений [186].
Возможность получения трансгенных растений основана на тотипотентности их некоторых клеток, т.е способности в определенных условиях под действием фитогормонов дифференцироваться в разных направлениях с образованием всех тканей организма растения и самого полноценного растения. Для создания трансгенного растения необходимо трансформировать культивируемые клетки, их протопласты или клетки в составе органов и тканей подходящим вектором, содержащим требуемый клонированный ген, отделить от ^трансформированных и получить из них целые трансгенные растения.
Селектируемые маркеры и гены-репортеры, используемые при трансформации клеток растений. Клетки растений чувствительны к некоторым антибиотикам, особенно тем из них, которые подавляют биосинтез белка в хлоропластах, в том числе ка-намицину и гигромицину. Поэтому в состав векторов вводят бактериальные гены устойчивости к таким антибиотикам под контролем генетических регуляторных элементов растений (табл. 6). В качестве других селектируемых маркеров в векторах растений используют гены устойчивости к гербицидам. Недавно в качестве селектируемого маркера стали применять ген маннозо-6-фосфат изомеразы (pmi): экспрессирующие его клетки приобретают способность использовать маннозу в качестве единственного источника углерода, а следовательно, расти на среде с этим углеводом. Современные технологии позволяют вести наблюдение за экспрессией трансгенов в растениях и с помощью визуальных методов. В частности, экспрессия гена (3-глюкуронидазы ((3-glucuronidase - GUS) придает трансформированным клеткам способность расщеплять 5-бром-4-хлор-3-индолил-(3-0-глюкуроновую кислоту (X-Gluc) и 4-метилумбел-лиферил-(3-0-глюкуроновую кислоту (MUG) [187]. Специфическое расщепление X-Gluc сопровождается освобождением соединения, которое под действием кислорода воздуха приобрета-
