Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Трансфекция клеток, опосредованная фосфатом кальция (calcium phosphate coprecipitation method), является одним из наиболее широко используемых и наименее воспроизводимых по эффективности методов ведения рекомбинантных ДНК [219]. Раствор СаС12 с помещенной в него ДНК медленно смешивается с фосфатным буфером, что сопровождается образованием нерастворимого фосфата кальция и одновременным осаждением ДНК. Суспензия вносится в чашки Петри с культивируемыми клетками. Через некоторое время частицы фосфата кальция, содержащие ДНК, сорбируется на поверхности клеток и проникают внутрь в процессе эндоцитоза. Далее небольшая фракция рекомбинантной ДНК оказывается в ядре, где может быть интегрирована в хромосому или некоторое время существовать во внехромосомном состоянии. Метод прост в своей реализации, однако высоко чувствителен к условиям проведения эксперимента (концентрациям ДНК и СаС12, значениям pH, продолжительности трансфекции) и поэтому трудно воспроизводим. При слишком длительной инкубации клеток с фосфатом кальция проявляется его цитотоксическое действие. С учетом этого, для каждой линии клеток требуется проведение тщательной оптимизации условий.
Метод трансфекции клеток, основанный на использовании ДЭАЭ-декстрана, является альтернативой рассмотренному выше кальций-фосфатному методу [220]. Этот подход широко используется для получения клеточных линий, временно экспрессирующих рекомбинантные гены. ДЭАЭ-декстран смешивают с ДНК в питательной среде с низким содержанием сыворотки, и смесь на некоторое время добавляют к культивируемым клеткам. Комплексы ДНК с ДЭАЭ-декстраном сорбируются на поверхности клеток и поступают внутрь с помощью эндоцитоза. Доставку
комплексов внутрь клеток можно стимулировать, повысив проницаемость клеточных мембран диметилсульфоксидом. К недостаткам метода следует отнести подавление роста клеток во время трансфекции, а также появление в самих клетках различных морфологических изменений. При этом стабильные трансфек-танты возникают редко. Трансфекция с применением ДЭАЭ-дек-страна является одним из примеров возможности использования катионных полимеров для осуществления этого процесса. Для эффективной трансфекции по тому же принципу можно использовать дендримеры (сильно разветвленные молекулы полимеров), полилизин, протамины и полиэтиленимин [221]. Вторая группа родственных методов основана на применении для тех же целей катионных липидов.
Липосомы в трансфекции. Использование липосом является еще одним популярным, эффективным и универсальным методом введения рекомбинантных ДНК в клетки животных и человека [222]. Для создания липосом в этом случае чаще всего используют катионные липиды, которые являются амфифильны-ми самоассоциируемыми молекулами, которые в присутствии ДНК, благодаря электростатическим и другим взаимодействиям, конденсируются в частицы, получившие название липоплексов (lipoplexes). Липоплексы, несущие суммарный положительный заряд, взаимодействуют с сиаловыми кислотами клеточных мембран и обеспечивают эффективное проникновение ДНК внутрь клеток в процессе эндоцитоза [223]. Хотя большинство ДНК попадает в лизосомы и деградирует, значительная их фракция доставляется в ядро трансфецируемых клеток.
Для получения липоплексов катионные липиды и ДНК смешивают в бессывороточной питательной среде, поскольку сыворотка препятствует их объединению, и культивируемые клетки кратковременно инкубируют в их присутствии. Метод позволяет осуществлять как временную, так и постоянную трансфекцию с образованием стабильных клеточных линий. По сравнению с ДЭАЭ-декстраном эффективность этих методов, по крайней мере, в 5-100 раз выше при получении временной трансфекции и в 3-20 раз при создании стабильных трансфектантов. При этом с помощью липосом удается осуществлять трансфекцию в сложных случаях тех клеточных линий, которые не поддаются введению рекомбинантных ДНК другими способами. Более того, данная группа методов допускает проведение трансфекции в суспензионных культурах, не требует митотического деления клеток в Момент проведения эксперимента и, как правило, высоковоспроизводима.
Конъюгативный перенос бактериальных генов в клетки животных. Перенос генов во время конъюгации бактериальных клеток, когда мужские и женские клетки вступают в контакт друг с другом через объединяющий их цитоплазматический мостик, является широко распространенным и хорошо изученным генетическим явлением [224, 225]. Недавно была продемонстрирована возможность конъюгативного переноса ДНК из бактериальных клеток в культивируемые клетки животных [226]. В этой серии экспериментов В.Л. Ватерсу удалось показать, что гены устойчивости к антибиотикам, находящиеся в составе конъюгатив-ной плазмиды Е. coli, переносятся с низкой частотой в клетки яичников китайских хомячков СНО К1 из бактериальных клеток, давая возможность клеткам-реципиентам выживать на селективной среде в присутствии соответствующих антибиотиков. При этом не происходило поглощения бактериальных клеток клетками животных посредством эндоцитоза, и перенос имел место в присутствии ДНКазы в питательной среде, что исключало непосредственный захват ДНК клетками из культуральной жидкости. Чужеродная ДНК реплицировалась в клетках животных, а экспрессия генов генетических маркеров происходила лишь в том случае, если гены находились под контролем эукариотических промоторов. Хотя конъюгативный перенос генов бактерий в клетки дрожжей, а также растений (Ti-плазмиды) известен давно, обсуждаемая работа впервые продемонстрировала возможность непосредственного обмена генами между бактериями и клетками высших животных. В том случае, если данный процесс удастся оптимизировать, у генной инженерии появится дополнительная возможность введения очень больших молекул ДНК в клетки животных, в том числе и в целях генотерапии.
