Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 52

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 221 >> Следующая

Другим распространенным носителем, разработанным для очистки белков, обладающих полигистидиновой меткой, является Talon, в состав которого входит Со2+-карбоксиметиласпартат (Со2+-СМА), иммобилизованный на твердом носителе [159]. Talon Позволяет выделять белки в более мягких условиях, чем те, которые допускает Ni2+-NTA и для этой хроматографической систе-**ы, по-видимому, характерно более низкое неспецифическое
связывание белков. Ее использование позволило разработать новую аффинную метку на основе 19-звенной природной nonn(His)-последовательности (HAT), которая позволяет производить очистку рекомбинантных белков в мягких условиях. В целом, система с полигистидиновой меткой позволяет производить очистку рекомбинантных белков из всех основных систем экспрессии, включая бактерии, клетки дрожжей, млекопитающих и насекомых. Благодаря небольшому размеру и низкому электрическому заряду метка оказывает незначительное влияние на активность рекомбинантного белка. В том случае, если это все-таки происходит, перенос аффинной последовательности с одного конца рекомбинантного полипептида на другой, как правило, решает проблему [160]. Использование системы не рекомендуется для очистки ферментов, содержащих ионы металлов в активном центре из за их возможного взаимодействия с NT А, а также в анаэробных условиях, которые уменьшают эффективность взаимодействия аффинной метки с №2+-1ЧТА-носителями.
Система FLAG. В этой системе используется короткая 8-звенная аминокислотная последовательность. Пептид FLAG специфически взаимодействует с антителами подклассов Ml, М2 и М5. При этом остается непонятным является ли это взаимодействие Са2+-зависимым [161, 162]. Условия очистки белков в такой системе неденатурирующие, однако их взаимодействие с носителями на основе моноклональных антител менее прочное, чем в вышеописанных системах с ионами металлов. Система на основе трехкратного повтора последовательности FLAG (3 х FLAG) позволяет обнаруживать до 10 фмолей синтезированного рекомбинантного белка. Последовательность FLAG может быть удалена энтерокиназой, которая специфична в отношении 5-звенной С-концевой аминокислотной последовательности (AspAspAspAspLysi) аффинной метки.
Система Strept-tag. Данная аффинная метка представляет собой семейство искусственных пептидов, разработанных для очистки белков на колонках с иммобилизованным стрептавидином (о стрептавидине подробнее см. в разделе 1.6.3.11) [163]. Мутантная форма стрептавидина, названная стрептактином (Strep-Tactin), с заменами аминокислотных остатков в положениях 44, 45 и 47 обладает большим сродством к пептиду Srept II, чем к исходному (последовательность см. в табл. 5). Рекомбинантные белки, несущие эту аффинную метку, связываются в мягких условиях с иммобилизованным биотином и могут быть элюированы производными биотина, например, дестиобиотином. Биотинилированные белки также могут связываться со стрептактином, однако такое взаимо-
действие можно заблокировать авидином. Такую систему рекомендуется использовать для очистки рекомбинантных белков в анаэробных условиях, а также для ферментов, содержащих в своем составе ионы металлов. При этом можно проводить совместную очистку субъединиц мембранных белков, не содержащих аффинной метки. Данная аффинная метка, кроме того, находит применение в эукариотическом клеточном дисплее (см. раздел II.2.3.2), и в последнее время становится все более популярной, в том числе, в исследованиях белок-белковых взаимодействий [164] и в приложениях с использованием ЯМР-спектроскопии.
Системы на основе с-шус-последовательностей. Мышиные моноклональные антитела 9Е10 к белку с-тус широко используется в качестве иммунохимического реагента в клеточной биологии и белковой инженерии [165]. Эпитоп, распознаваемый антителами, который представляет собой последовательность из 11 аминокислотных остатков, может быть экспрессирован в составе различных белков и остается распознаваемым антителами. Эта аффинная метка используется в Западном блоттинге, для иммунопреципитации белков, в проточной цитометрии, а также для мониторинга экспрессии генов на уровне трансляции в бактериальных и эукариотических системах, в том числе, и для быстрой очистки рекомбинантных белков, которые могут быть закристаллизованы [166, 167]. Система часто используется для обнаружения рекомбинантных белков, но редко - для их выделения в чистом виде.
Система S-Tag. Работа системы основана на взаимодействии 15-звенного S-пептида рибонуклеазы А со 103-звенной последовательностью того же фермента, которые образуют специфический очень прочный комплекс (Kd~ 10~9 М) [168]. Последовательность S-Tag присоединяют генно-инженерными методами к N-концевой части рекомбинантного белка в составе экспрессирующего вектора и по завершении экспрессии гибридный белок выделяют с помощью аффинной хроматографии на колонке с протеин S-агарозой. Элюирование целевого белка можно осуществлять с помощью энтерокиназы, распознаваемую последовательность которой вводят в виде линкера между целевым рекомбинантным белком и последовательностью S-Tag. Для тех же целей может быть использован и тромбин в сочетании с расщепляемой этой протеиназой аминокислотной последовательностью. В Данном случае с колонки освобождается нативный рекомбинантный белок с правильной N-концевой последовательностью. Альтернативно, элюирование гибридного белка с колонки можно проводить в денатурирующих условиях (ЗМ гуанидинтиоциана-том, 0,2 М цитратом, pH 2, или 3 М MgCl2). В этом случае маркер-
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 221 >> Следующая
Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed