Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
У наиболее важной для генной инженерии грамположитель-ной бактерии В. subtilis компетентность в искусственных условиях можно развить, выращивая клетки в специальных минимальных питательных средах, содержащих глюкозу в качестве источника углерода, а также ионы Mg2+ и Са2+ [207]. Ионы Mg2+ необходимы для активации специфических нуклеаз, участвующих в захвате экзогенной ДНК. Одним из практических способов достижения компетентности является двухступенчатое понижение скорости роста клеток в культуре. Биосинтетические процессы в компетентных клетках замедлены, что может проявляться, в ча-
стности, в их устойчивости к антибиотикам (ампициллину). Биосинтез макромолекул ассоциирован, главным образом, с индукцией системы SOB-репарации (аналог SOS-системы), что является следствием накопления брешей в хромосомной ДНК бактерий из-за нарушений нормальной репликации при замедлении скорости роста.
Молекулярные события, связанные с развитием компетентности у В. subtilis, схематически изображены на рис. 15, д. В процессе становления компетентности клетки экскретируют два пептида: 9-10-звенный модифицированный фермой СошХ и фактор, стимулирующий компетентность (competence stimulating factor - CSF). Покинув клетку, оба фактора взаимодействуют как с ней самой, так и соседями, создавая состояние бактериальной культуры, называемое восприятием кворума (quorum sensing), одного из способов межклеточного общения грамположитель-ных и грамотрицательных бактерий, при котором низкомолекулярные эффекторы (аутоиндукторы), синтезируемые одним организмом, индуцируют экспрессию генов в других. У грамотрицательных бактерий в качестве аутоиндукторов часто выступают ацетилированные лактоны гомосерина. СотХ далее взаимодействует с мембранной протеинкиназой СотР, которая фос-форилирует саму себя и белок Сот А. Фактор CFS, синтезируемый в то же самое время, воспринимается мембранной олигопеп-тидпермеазой (ОРР), которая импортирует его внутрь клетки, где фактор выполняет роль ингибитора дефосфорилирования СотА. Фосфорилированный СотА активирует srf-оперон, состоящий из четырех генов биосинтеза антибиотика сурфактина. Среди них ген comS кодирует белок, который активирует белок СотК путем освобождения его из комплекса. Во время логарифмической фазы роста бактериальных клеток СотК находится в комплексе с белком МесА, направляющим СотК на путь про-теолитической деградации протеиназой С1рС. Активированный белок СотК стимулирует свой собственный биосинтез и транскрипцию поздних генов компетентности.
Компетентные клетки В. subtilis имеют 20-50 мест связывания дцДНК [208]. ОцДНК, РНК или ДНК-РНК-гибриды переносятся в клетку крайне неэффективно. Ключевую роль в процессе связывания играет трансмембранный белок СотЕА, который связывает преимущественно дцДНК, а также белки группы ComG (ComGA-ComGG) (рис. 15, б). Последние обеспечивают формирование канала в плотном слое пептидогликана. После взаимодействия с СотЕА дцДНК быстро становится од-Ноцепочечной под действием ассоциированной с СотЕА экзо-
нуклеазы (N). Длина фрагментов оцДНК составляет 7-15 т.п.о. Белок СошЕС формирует трансмембранный водный канал, через который ДНК может быть перенесена в обоих направлениях: как 5'> 3', так и 3'> 5'. Белок ComFA обладает активностью геликазы и за счет гидролиза АТР, по-видимому, поставляет энергию, необходимую для переноса ДНК через мембрану. ОцДНК, проникшая в клетку, далее ассоциируется с белками RecA и SSB, что необходимо для ее интеграции в бактериальную хромосому. С момента добавления ДНК к компетентным клеткам до появления трансформантов проходит не менее двух мин. Такого рода эксперименты, особенно опыты по котранс-формации удаленных маркеров, позволили определить скорость переноса ДНК в клетку как постоянную на уровне 180 нт/сек при 28 °С.
Процесс интеграции ДНК в процессе трансформации грампо-ложительных бактерий разделяют на пять стадий: 1) интернализация ДНК и ее расположение в непосредственной близости от хромосомы; 2) образование нестабильного донорно-реципиент-ного комплекса; 3) образование стабильного нековалентного комплекса; 4) образование ковалентного комплекса между до-норной и реципиентной ДНК; 5) разрешение ковалентного гетеродуплекса, содержащего ошибочно спаренные нуклеотиды. Подробное рассмотрение всех этих вопросов выходит за рамки круга обсуждаемых нами проблем. Замечу только, что переход между стадиями 2 и 3 блокируется каумермицином, ингибитором ДНК-гиразы, что указывает на важную роль пространственной структуры ДНК в рассмотренном процессе рекомбинации между донорной ДНК и реципиентной ДНК бактериальной хромосомы. После установления компетентности клетки В. subtilis остаются в таком состоянии в течение нескольких часов.
-------->>
Рис. 15. Развитие природной компетентности (а) и проникновение ДНК в клетку (б) у В. subtilis [20]
Становление компетентности инициируется фермоном СотХ и фактором, стимулирующим компетентность CSF; СотХ воспринимается гистидиновой протеинкиназой СотР, которая после аутофосфорилирования, фосфорилирует белок СотА, активирующий srf-оперон, связанный в другой рамке считывания с геном белка ComS; CSF является ингибитором дефосфорилирования СотА, а также активирует собственный синтез через свой ген phrC; ComS освобождает из предсуществующего комплекса СотК, который стимулирует транскрипцию как своего собственного гена, так и поздних генов компетентности; белок YlbF повышает активность ComS, а также участвует в спорообразовании.
