Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
клеточных мембран будут кратко рассмотрены ниже. Сам же механизм попадания экзогенной ДНК в ядра пока еще мало изучен. По-видимому, в этом случае имеет место пассивное перемещение линейных молекул через ядерный поровый комплекс без участия системы транспорта ядерных белков [211]. На основании биологических последствий, сопровождающих возникновение клеток-трансфектантов, различают стабильную трансфекцию, когда рекомбинантные ДНК интегрируются в хромосомы клеток-ре-ципиентов и становятся их неотъемлемой частью, а также временную трансфекцию (transient transfection), при которой молекулы рекомбинантной ДНК существуют и транскрибируются в ядрах во внехромосомном состоянии непродолжительное время.
Перенос генов с помощью вирусов основан на природном процессе вирусной инфекции. Эффективные векторы созданы на основе хромосомной ДНК ретровирусов, вирусов SV40, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вируса вакцины, вируса герпеса и др. Ретровирусные векторы используются особенно часто для переноса генов в клетки животных [212].
Перенос генов, опосредованный клеточными рецепторами, основан на интернализации рецепторов в процессе эндоцитоза. В этом случае природный лиганд рецептора используют для адресной доставки молекул ДНК к клеткам, обладающим такими рецепторами. В одной из таких систем в качестве переносчика рекомбинантной ДНК применяется конъюгат трансферрина с полилизином. Последний, являясь поликатионом, прочно взаимодействует с ДНК и осуществляет ее конденсацию с образованием плотных комплексов [213].
Электропорация. Метод может быть использован для введения ДНК в клетки любых типов. Кратковременное (10 мксек-100 мсек) воздействие на суспензию клеток с экзогенной ДНК электрическим полем высокой напряженности (50-1500 V/см) сопровождается локальным нарушением целостности мембран с образованием микропор (диаметр 20-120 нм), через которые заряженные молекулы, в том числе и ДНК, как линейная, так и су-перскрученная, проникают внутрь клеток [214]. Поры закрываются спустя несколько мсек после прекращения действия импульса. Тем не менее даже в оптимальных условиях в результате этого шока приблизительно половина клеток погибает. Электропорированные клетки далее инкубируют в течение 48 час на неселективной питательной среде, после чего производят отбор трансфектантов по селектируемому маркеру, например, на среде с антибиотиком неомицином. Наличие свободных концов в линейных векторах способствует их интеграции в хромосомы кле-
ток-реципиентов и образованию стабильных трансфектантов. &1етод электропорации особенно эффективен для переноса внутрь клеток небольших молекул ДНК, включая бактериальные плазмиды, и его эффективность быстро уменьшается с увеличением размера фрагментов. Тем не менее, эффективность электропорации еще остается на достаточно высоком уровне, позволяющем получать высококачественные клонотеки с использованием искусственных хромосом ВАС и РАС (размер клонированных фрагментов - 100-300 т.п.о.). Трансфекция клеток животных методом электропорации гораздо менее эффективна по сравнению с бактериальными, так как исходное количество клеток в суспензии в этом случае значительно ниже, а ДНК, попадая в цитоплазму, подвергается быстрой деградации. В этой связи повышение эффективности метода может быть достигнуто путем обеспечения защиты ДНК от нуклеазного гидролиза и снабжением молекул сигнальными последовательностями, которые после объединения с соответствующими белками обеспечивали бы направленный перенос молекул в ядра трансфецируе-мых клеток.
Создание микроотверстий в клеточных мембранах с помощью лазера. Кратковременное облучение суспензии клеток с помощью лазера обратимо создает микроотверстия в клеточных мембранах, через которые экзогенная ДНК может проникать внутрь клеток [215].
Микроинъекции. Введение ДНК внутрь клеток с помощью этого метода осуществляют с использованием микроманипуляторов, оснащенных стеклянными микрокапиллярами, которыми прокалывают мембраны клеток. Метод особенно интенсивно используется при создании трансгенных животных. В этом случае большие фрагменты ДНК из векторов YAC, ВАС или РАС вводят непосредственно в ядра индивидуальных клеток. Из всех используемых методов только микроинъекция позволяет вводить в клетки строго дозированное количество молекул ДНК.
Бомбардировка клеток микрочастицами. Эта группа методов, иначе называемых баллистической (biolistic) инъекцией, первоначально была разработана для введения рекомбинантных ДНК в клетки растений и в настоящее время приспособлена также для введения нуклеиновых кислот в клетки микроорганизмов, животных и человека как in vitro, так и in vivo [210, 216]. При этом подходе микрочастицы, содержащие ДНК, с помощью порохового заряда, сжатого гелия или электрического поля разгоняют до высоких скоростей (~1000 м/сек) и поток частиц кратковременно направляют на поверхность клеток. Некоторые из ча-
стиц после проникновения внутрь клеток вместе со связанной с ними ДНК достигают ядер, что может сопровождаться стабильной трансфекцией клеток-мишеней. В качестве носителей ДНК используют микрочастицы вольфрама, золота или льда. Баллистическая инъекция позволяет вводить нуклеиновые кислоты не только в ядра клеток, но и находящиеся непосредственно в клетках органеллы: митохондрии и хлоропласты [217]. В настоящее время данные подходы широко используются в генотерапии, для получения трансгенных животных и растений, индукции сайлен-синга генов небольшими интерферирующими РНК (siPHK), а также для прямой иммунизации организмов с помощью ДНК-вакцин в виде плазмидных ДНК, действие которых особенно эффективно против вирусных инфекций [218].
