Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Р - в генах обозначает промотор, а рядом с белками - ортофосфатную группу; ОРР - олигопептидпермеаза
Пептидошикан
Мембрана
сотК сотХ X
к
р
srf S
р
phrC
Р
Споруляция
Поздние гены споруляции
YlbF
0
ДНК
RecA <У SSB
3.8.2. Искусственная компетентность Е. coli
Клетки Е. coli не обладают природной компетентностью. Однако ввиду важности этого организма для молекулярной генетики, были разработаны методы, позволяющие придавать Е. coli искусственную компетентность. При искусственной компетентности трансформирующие плазмиды взаимодействуют со специфическими каналами на внешней поверхности клеток. Каждая клетка обладает 10-200 каналами, обеспечивающими транспорт питательных веществ и других ингредиентов, необходимых для роста и размножения бактерий. В опытах по конкуренции трансформирующей плазмиды pBR322 и ее производной pXf 1 было установлено, что когда их смешивают в отношении 1:1000 (в сумме 10 молекул на клетку), это никак не сказывается на эффективности трансформации pBR322. Уменьшение этой пропорции до 1:10 000 или 1:100 000 (100 молекул на клетку) понижало эффективность трансформации лишь на 60 и 80%, соответственно. Это показывает, что имеется много каналов для проникновения ДНК, а сами клетки должны конкурировать друг с другом за ее захват.
В настоящее время установлено, что при низких температурах и в присутствии двухвалентных катионов клетки Е. coli и экзогенная ДНК продуктивно взаимодействуют друг с другом и экзогенная ДНК может с высокой эффективностью проникать внутрь бактериальных клеток. Частоту трансформации и трансфекции клеток Е. coli можно повысить разными способами. Среди них наиболее популярными являются тепловой шок, введение в инкубационную смесь одновалентных катионов (Rb+), хлорида гексаминкобальта (III) или выращивание бактериальных клеток на среде с повышенным содержанием ионов Mg2+ (10-20 мМ).
Предполагается, что в присутствии двухвалентных катионов или диметилсульфоксида при низкой температуре или в результате действия других вышеупомянутых агентов нарушается целостность и структура липополисахаридного слоя бактериальных клеток, что может сопровождаться демаскировкой или повышением доступности каналов захвата, которые могут быть ассоциированы с местами взаимодействия внешней и внутренней мембран (т.н. мостики Байера). Хлорид гексаминкобальта (III) возможно специфически усиливает взаимодействие ДНК с каналами.
Современные методики трансформации бактериальных клеток позволяют получать до 107— 108 трансформантов или транс-фектантов на 1 мкг суперскрученной плазмидной ДНК. Посколь-
ку трансформация и трансфекция проводятся при низких концентрациях экзогенной ДНК, а для появления у трансформированной бактерии устойчивости к антибиотикам или развития фаговой бляшки достаточно проникновения внутрь бактериальной клетки одной молекулы рекомбинантной ДНК, образовавшиеся колонии или бляшки трансформантов и трансфектантов содержат, как правило, только один тип рекомбинантных молекул ДНК с идентичными вставками клонируемых последовательностей нуклеотидов. В случае же проникновения в бактериальные клетки рекомбинантных плазмид с разными вставками клонируемой ДНК в процессе клеточных делений происходит их быстрая сегрегация в разные клетки, поскольку они относятся к одной группе совместимости (см. раздел З.1.1.).
Еще более высокой эффективности трансформации (до 109-1010 трансформантов на 1 мкг ДНК) достигают при использовании электропорации [209]. В этом случае клетки вместе с плаз-мидной или фаговой ДНК помещают в небольшую ячейку между двумя электродами и подвергают кратковременному (3-5 мс) воздействию электрического поля высокой напряженности. Быстрая поляризация клеточных мембран приводит к их обратимому повреждению (образованию пор), сопровождаемому повышением их проводимости и проницаемости для макромолекул. В это время происходит эффективный перенос экзогенных молекул ДНК внутрь клеток, подвергнутых электрическому шоку.
После того как рекомбинантные молекулы ДНК введены в бактериальные клетки и получены бактериальные колонии или фаговые бляшки, каждая из которых содержит рекомбинантную ДНК только одного типа, возникает важная задача отбора тех колоний или бляшек, которые заключают в себе искомые последовательности нуклеотидов рекомбинантных ДНК.
3.8.3. Способы и последствия введения ДНК
в культивируемые клетки животных
Современные технологии позволяют вводить рекомбинантные ДНК в клетки любых типов и исследовать последствия экспрессии в них соответствующих генов. Этот процесс переноса генов в клетки высших организмов также, как и упомянутое выше введение ДНК бактериофагов в бактериальные клетки, называют трансфекцией. Трансфекция эукариотических клеток, как правило, включает два основных этапа: перенос ДНК через клеточные мембраны в цитоплазму клеток и последующий их транспорт в ядра. Часто используемые приемы преодоления барьера
