Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
У— У— $— У— 3'—
3'
С
концам стандартными методами. Поскольку длина кДНК редко превышает несколько т.п.о., в качестве вектора обычно используют плазмиды или инсерционные векторы на основе фага X (например, gtlO или gtll).
Необходимо иметь в виду, что синтезированные таким способом молекулы кДНК редко заключают в себе всю последовательность мРНК-матрицы. Обратная транскриптаза обычно не транскрибирует цепь мРНК до конца, кроме того потеря информации происходит при гидролизе одноцепочечного участка. Для преодоления этих затруднений в качестве затравок при синтезе первой цепи кДНК часто используют вместо олиго(с1Т)-праймеров случайные праймеры - короткие олигонуклеотиды, которые могут отжигаться с матрицей, в том числе и ближе к ее 5'-концу. Кроме данного преимущества, использование случайных праймеров позволяет получать кДНК для бактериальных РНК и геномных РНК вирусов, которые, как правило, не содержат протяженных 3'-концевых поли(А)-последовательностей. Системы синтеза кДНК, основанные на использовании случайных праймеров, в настоящее время продаются многими фирмами. Использование терминальной трансферазы для присоединения гомополимера к 3'-концу первой цепи кДНК позволяет избежать необходимости использования 3'-концевой петли для синтеза второй цепи, так как в этом случае в качестве затравки уже можно использовать праймер, комплементарный гомополимерному участку. Получить дополнительную информацию о 5'-концевых последовательностях мРНК можно с помощью эффективного метода амплификации 5'-концов кДНК (5'-RACE), уже рассмотренного в разделе, посвященном полимеразной цепной реакции, принцип которого предполагается рассмотреть во втором томе монографии.
4.1.3. Случайные и упорядоченные клонотеки
В рассмотренных выше случаях клонотеки последовательностей представляли собой суспензии рекомбинантных бактериальных клеток или фаговых частиц, в которых отдельные клоны, представленные многими тысячами индивидуальных частиц, никак не были упорядочены в пространстве друг относительно друга. Такие клонотеки отвечают многим генно-инженерным задачам, например, могут быть эффективно использованы для отбора клонов методом гибридизации колоний (см. ниже). Однако в ряде случаев, например, когда процесс отбора занимает длительное время и требует анализа каждого индивидуального клона, невозможно одновременно исследовать все клоны клонотеки. По-
этому после анализа небольшого числа клонов снова приходится обращаться к клонотеке за новой аликвотой бактериальных клеток, но в результате в анализ со значительной вероятностью могут попадать клоны, которые уже были изучены. Для того, чтобы избежать такого повторения, после первого рассева трансформированных клеток выросшие колонии, перед тем как начать с ними работать, упорядочивают, например, путем перекалывания в виде матрицы на чистую чашку Петри с присвоением каждому клону определенного номера или подращивания индивидуальных клонов в отдельных лунках планшетов для микротитрования. Это позволяет после обнаружения рекомбинантной ДНК, обладающей требуемыми свойствами, легко вернуться к соответствующему исходному клону и далее работать только с ним, автоматизировать процесс скрининга и получать идентичные копии клонотеки. В результате таких простых манипуляций клонотека последовательностей поддерживается в виде матрицы (arrayed (gridded) library), в которой несмотря на пространственную упорядоченность отсутствует какая-либо внутренняя логика, которая бы связывала друг с другом соседние клоны [232].
Такая связь достигается в упорядоченных клонотеках в которых клоны, располагающиеся по соседству, содержат перекрывающиеся последовательности, а весь их ряд представляет непрерывную последовательность генома [233, 234]. Естественно, упорядочивание таких клонов возможно только после секве-нирования клонированных последовательностей ДНК или определения особенностей их первичной структуры другими способами. Упорядоченные клонотеки содержат гораздо меньшее число клонов по сравнению с неупорядоченными, поскольку в последних каждый клон многократно дублирован. С такими клонотека-ми проще работать, но их значительно труднее создавать. Упорядоченные клонотеки ВАС-клонов ДНК человека были использованы международным консорциумом при выполнении программы “Геном человека”. В отличие от этого, американская фирма Selera при решении той же задачи пошла по другому пути, используя случайные клонотеки и метод дробовика (shot-gun), в котором осуществляли тотальное секвенирование потенциально перекрывающихся случайно выбираемых из клонотеки клонов, которые объединяли в непрерывную последовательность с помощью вычислительной техники.
Выше были рассмотрены условия, которые необходимо соблюдать для получения репрезентативных клонотек геномной ДНК. Однако во многих случаях не возникает необходимости работать с полными клонотеками генов, и исследователи ограничи-
6. Патрушев Л.И. Т. 1
161
ваются неполными клонотеками, обогащенными отдельными участками генома. Так, клонотеки кДНК заключают в себе последовательности нуклеотидов, которые в виде зрелых мРНК специфически экспрессируются в различных клетках или тканях. То же можно сказать и о клонотеках повторяющихся последовательностей нуклеотидов, отобранных из препарата суммарной ДНК на основании кинетики их реассоциации.
