Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
транскрипции VirG. Белок VirA в комплексе с лигандом фосфо-рилирует VirG, который после этого приобретает способность взаимодействовать с регуляторной последовательностью vir-оперона и активировать его транскрипцию.
Активация v/r-генов приводит к образованию одноцепочечной копии Т-области Ti-плазмиды. Этот процесс происходит при участии белков VirDj и VirD2, которые вносят одноцепочечные разрывы по обеим сторонам Т-области, фланкированной 24-нук-леотидными повторами. Белок VirD2 остается ковалентно связанным с цепью Т-ДНК, и этот нуклеопротеиновый Т-комплекс переносится в клетки [191,192]. Транспорт обеспечивают 11 virB-генов, продукты которых формируют структуры, напоминающие половые ворсинки Е. coli. Кроме того, белок VirE2 покрывает оболочкой переносимую одноцепочечную ДНК, предохраняя ее от деградации и также, как и VirD2, содержит сигнал ядерной локализации (NLS), который обеспечивает перенос Т-комплекса из цитоплазмы в ядро.
Введение генов непосредственно с помощью Ti-плазмид не используется, поскольку приводит к образованию опухолевых клеток, из которых невозможно получить целое растение. Для этих целей применяют векторные молекулы на основе Ti-плазмид с удаленными онкогенами. Вместо онкогенов в вектор можно встраивать стандартными методами по сайтам рестрикции последовательности клонируемой ДНК [193, 194]. В таких челночных векторных плазмидах сайты рестрикции, по которым производят клонирование, расположены в искусственной Т-области, фланкированной вышеупомянутыми повторами. В качестве селектируемых маркеров в этих плазмидах используют расположенные в Т-области гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам, которые позволяют отбирать трансформированные клетки растений. После введения клонируемой последовательности рекомбинантным вектором трансформируют клетки агробактерий и с их помощью при участии v/r-генов осуществляют перенос всей генно-инженерной конструкции в клетки растений. Гены вирулентности могут находиться как в составе самого вектора, так и в Ггаяя-положении на плазмиде-помощнике. Для получения генетически модифицированных растений суспензию агробактерий можно инкубировать с протопластами, интактными клетками, тканями, листьями или даже целыми растениями. Во всех случаях достигается высокоэффективный перенос рекомбинантной ДНК в геном трансформируемых клеток. Интеграция рекомбинантной ДНК происходит случайным образом с небольшим предпочтением участков активно транскрибируемых генов.
Для введения больших фрагментов ДНК в клетки растений в последнее время были получены соответствующие космидные векторы [195], а также векторы на основе искусственных бактериальных хромосом (ВАС), получившие название ТАС-векторов (transformation-competent bacterial artificial chromosomes) [196]. ТАС-векторы могут быть реплицированы как в клетках Е. coli, так и агробактерий, что позволяет с помощью этих микроорганизмов вводить в клетки растений фрагменты ДНК длиной более 150 т.п.о.
Векторы для переноса рекомбинантных генов в хлоропласты высших растений. Получение трансгенных растений, содержащих генетически измененные хлоропласты, является одним из быстро развивающихся направлений современной генной инженерии растений [197]. Интерес к этой области исследований определяется большей безопасностью таких трансгенных растений в отношении загрязнения окружающей среды. Поскольку хлоропласты не переносятся с пыльцой, значительно уменьшается опасность распространения трансгенов среди перекрестно опыляемых растений близких видов. Кроме того, сама пыльца трансгенных растений менее токсична для насекомых, которые не являются мишенью ее токсического воздействия. Для генома хло-ропластов (пластома) характерен высокий уровень полиплоидии (103-105 копий на клетку), поэтому отдельная клетка с трансформированными хлоропластами содержит тысячи копий трансгена, что позволяет получать очень высокий уровень экспрессии соответствующих рекомбинантных белков (до 25% от суммарного растворимого клеточного белка).
Векторы для трансформации хлоропластов представляют собой кольцевые молекулы ДНК, содержащие маркерный ген для отбора трансформантов, а также два участка длиной 1-2 т.п.о. каждый, гомологичные последовательностям пластома, в которые происходит интеграция вектора с помощью гомологичной рекомбинации [198]. В геноме хлоропластов описано, по крайней мере, 16 сайтов, по которым удалось получить продуктивную интеграцию вектора. Гомологичные последовательности, получившие название LTR- (left) и RTR-последовательностей (right targeting regions), фланкируют полилинкер, по которому производят клонирование исследуемых фрагментов ДНК. В зависимости от размера пластома данная векторная система позволяет вводить в геном хлоропластов фрагменты ДНК длиной до 50 т.п.о., содержащие от 20 до 30 генов.
Для получения эффективной экспрессии клонированных генов их вводят между двумя кассетными последовательностя-
ми
ми вектора. 5'-Концевая PL-кассета (promotor and leader) содержит промотор и регуляторные последовательности, обеспечивающие трансляцию синтезируемой с этого промотора мРНК, которые могут быть либо 5'-концевой нетранслируемой областью (5' UTR), либо 5'-концевым участком, контролирующим трансляцию (5' TCR), включающим, в свою очередь, 5' UTR и участок, кодирующий N-концевую часть лидерного пептида. Т-кассета содержит Э-иТЯ-последовательность, которая стабилизирует мРНК, что является одним из условий достижения высокого уровня экспрессии трансгена в хлоропластах. Для получения эффективной транскрипции клонированного гена часто используют сильный Рггп-промотор оперона рРНК (<ггп). В современных векторах присутствуют системы последовательностей, позволяющие убирать из стабильных трансгенных растений маркерные последовательности для предотвращения распространения генов устойчивости к антибиотикам в окружающей среде, а также для более устойчивой экспрессии самих трансгенов.
