Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Чем короче фрагменты, используемые для получения клонотек генов, и чем сложнее исследуемый геном, тем большее число клонов необходимо получить, чтобы клонотека была полной. Например, для того чтобы создать геномную клонотеку бактерий из фрагментов ДНК длиной в 20 т.п.о., в которой любая последовательность была бы представлена с вероятностью 99%, необходимо иметь 460 клонов, тогда как для млекопитающих это число возрастает до 600 000, а для покрытосеменных растений оно еще в ~10 раз больше. Отсюда следует, что в случае получения репрезентативных клонотек генов бактерий для решения такой задачи вполне достаточно плазмидных векторов, несмотря на их небольшую емкость. В то же время использование плазмид для создания полных клонотек генов млекопитающих или растений совершенно бесперспективно, так как потребовало бы поддержания в клонотеке огромного количества клонов, многие из которых с большой вероятностью могут быть утрачены.
Размер клонотеки, которая будет представлять с требуемой вероятностью любую последовательность исследуемого генома, можно рассчитать по формуле:
к-ад-л
1п(1-/)’
«Де N - требуемое число клонов, Р - вероятность того, что кло-йотека содержит требуемую последовательность ДНК, / - доля г©нома, в среднем, представленная в каждом клоне, которая выделяется путем деления среднего размера вставки на размер ис-
следуемого генома. Эта формула позволяет произвести расчет числа независимых клонов, т.е. числа рекомбинантных бактерий или фаговых частиц, которые необходимо получить непосредственно после трансформации или трансфекции компетентных клеток. После ресуспендирования колоний или фаговых бляшек происходит амплификация клонотеки, в которой каждый клон уже будет представлен тысячами бактерий или фаговых частиц.
Оценку качества клонотеки осуществляют путем определения среднего размера вставок в случайно выбранных клонах.
Клонотеки, полученные с использованием бактериальных клеток, обычно хранят при -70°С в виде суспензии в 30% глицерине, а суспензии фаговых частиц - в диметилсульфоксиде, что предохраняет клетки и вирусные частицы от гибели при замораживании и оттаивании. Этой процедуры, впрочем, рекомендуется избегать для большей сохранности клонотеки и отбирать бактерии или фаговые частицы без оттаивания основной суспензии. В этой связи бывает полезно исходную клонотеку хранить отдельно, а на ее основе получить вторичную клонотеку, которую, разделив на несколько частей, использовать в повседневной работе, оттаивая каждую часть ограниченное число раз.
4.1.2. Клонотеки кДНК
При конструировании клонотек кДНК прежде всего проводят очистку мРНК хроматографией на олиго-сГГ-целлюлозе, которую используют в качестве матрицы при обратной транскрипции (рис. 16) [228, 229]. Обратная транскриптаза (как и ДНК-за-висимая ДНК-полимераза) для своего функционирования требует затравки в виде олигонуклеотида, как правило олиго(сГГ), который отжигают с 3'-концевой поли(А)-последовательностью мРНК [230]. Элонгируя этот праймер, обратная транскриптаза синтезирует первую цепь к ДНК. Удаление РНК-матрицы из гибрида проводят с помощью РНКазы Н или путем щелочного гидролиза мРНК. Образовавшиеся молекулы оцДНК имеют тенденцию самопроизвольно формировать вторичную структуру, что приводит к образованию структуры типа “стебель-петля” на 3-конце оцДНК. Этот конец, в свою очередь, используется в качестве затравки при синтезе второй цепи кДНК ДНК-полимеразой I. В итоге образуется дцДНК, обе цепи которой на одном конце соединены между собой петлей из оцДНК. Петлю удаляют инкубацией с S1 -нуклеазой, специфически гидролизующей одноцепочечные нуклеиновые кислоты. Альтернативно в цепи мРНК, использованной в качестве матрицы при синтезе первой цепи
------:--------------ААААА 3' мРНК
Олиго(сПГ)-праймер
---------------------ААААА 3' мРНК
^_ттттт 5, Праймер Обратная транскриптаза
---------------------ААААА мРНК
---------------------ТТТТТ ДНК
Удаление мРНК (гидролиз щелочью или РНКазой Н)
Образование шпильки
Синтез ДНК ДНК-полимеразой
f^p f^p f^p f^p f^p
с—....................................
Удаление шпильки Достройка концов
______________________* ДНК-полимеразой_________ Двухцепочечная
------------------------------------------------ кДНК
Рис. 16. Синтез кДНК на матрице мРНК обратной транскриптазой [273]
кДНК, с помощью РНКазы Н делают одноцепочечные разрывы [231]. Образовавшиеся в итоге фрагменты мРНК далее используются ДНК-полимеразой IЕ. coli в качестве затравок при синтезе второй цепи кДНК. Повторная инкубация кДНК с ДНК-полиме-разой приводит к окончательному “затуплению” ее концов, концы кДНК фосфорилируют с помощью полинуклеотидкиназы, что необходимо для проведения последующего клонирования этих макромолекул.
Для клонирования к концам кДНК присоединяют с помощью ДНК-лигазы олигонуклеотидные адаптеры, содержащие сайты рестрикции, необходимые для соединения с линеаризованным вектором. После этого кДНК фракционируют по размерам, очищают от оставшихся молекул адаптера и клонируют по липким
