Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 54

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 48 49 50 51 52 53 < 54 > 55 56 57 58 59 60 .. 221 >> Следующая

ров и легко обнаруживаются по активности GST или иммунологическими методами. Последовательность GST обычно удаляют из гибридного полипептида с помощью специфических про-теиназ: тромбина или фактора Ха. Гибридные белки на основе GST стали одним из основных инструментов молекулярной биологии. Они используются для изучения белок-белковых и белково-нуклеиновых взаимодействий [179, 180].
Белок, связывающий мальтозу (maltose-binding protein -МВР) с молекулярной массой 40 кДа, кодируется геном malE Е. coli К12. Гибридные белки, содержащие в своем составе МВР, могут быть очищены в один этап с помощью аффинной хроматографии на амилозе, стабилизированной поперечными сшивками [181]. Kd этого комплекса находится в микромолярном диапазоне. Объединение МВР с основным (особенно эукариотическим) рекомбинантным белком в одной полипептидной цепи повышает растворимость последнего, что в ряде случаев предотвращает его агрегацию при сверхэкспрессии в бактериальных клетках. Система МВР широко используется для очистки рекомбинантных белков [182].
В целом, введение аффинных меток в виде обсуждавшихся выше пептидных и полипептидных последовательностей существенно облегчает очистку меченых таким образом рекомбинантных белков, а также предоставляет дополнительные возможности наблюдать за эффективностью экспрессии рекомбинантных генов. Выбор для этих целей системы очистки зависит от конкретного белка, который предстоит получать в очищенном состоянии, а также от целей его дальнейшего использования. В ряде современных систем в рекомбинантные белки вводится двойная аффинная метка, одна из которых служит для очистки белка, а другая - для мониторинга за его биосинтезом. Также с помощью двойной метки может быть достигнута большая степень очистки рекомбинантных белков. Разработаны множественные аффинные аминокислотные последовательности, которые включают в себя кальмодулин-связывающий пептид, специфический сайт расщепления протеиназой и белок А для иммобилизации всей рекомбинантной конструкции. С помощью этих систем удается изучать белок-белковые взаимодействия путем выделения соответствующих белковых комплексов при исследованиях про-теома [183, 184]. Методы иммобилизации белков с помощью аффинных последовательностей используются при создании пептидных и белковых микрочипов, клонотек на их основе, для адресной доставки белков и во многих других приложениях. О некоторых из них будет дополнительно рассказано в разделе II.3.2.
3.7. Векторы для переноса ДНК в клетки животных и растений
Все основные принципы, используемые при конструировании бактериальных векторов, применимы и для получения векторов эукариотических клеток. Как и в случае бактерий, эукариотический вектор представляет собой небольшую молекулу ДНК, способную автономно реплицироваться в клетках животных или растений. Помимо последовательностей нуклеотидов, обеспечивающих репликацию, эукариотические векторы могут содержать гены, используемые в качестве селектируемых маркеров, а также один или несколько уникальных сайтов рестрикции, по которым производится встраивание клонируемых последовательностей нуклеотидов ДНК. Поскольку непосредственное клонирование рекомбинантных ДНК в клетках животных или растений было бы дорогостоящей и малоэффективной процедурой, эукариотические векторы используют, как правило, для получения экспрессии уже клонированных последовательностей нуклеотидов в клетках высших эукариот, а сам процесс клонирования проводят в бактериях. Следовательно, эукариотические векторы, помимо всего прочего, должны быть челночными векторами. Для экспрессии в клетках рекомбинантные ДНК помещают под контроль регуляторных элементов, узнаваемых и используемых ферментативными системами эукариотических клеток.
В отличие от бактерий в клетках эукариот внехромосомные, автономно реплицирующиеся генетические элементы типа бактериальных плазмид встречаются редко. Поэтому при конструировании векторов, способных реплицироваться и осуществлять экспрессию в клетках животных, чаще всего используют регуляторные генетические элементы вирусов животных или, в зависимости от задач, эукариотических генов домашнего хозяйства, а также генов, для которых характерна тканеспецифическая экспрессия.
3.7.1. Экспрессирующий вектор pTriEx
Структура двух современных векторов, предназначенных для обеспечения экспрессии клонированных генов в клетках животных, представлена на рис. 14 (Novagen, США).
Вектор pTriEx™ “широкого спектра действия” обеспечивает кратковременную экспрессию рекомбинантных генов в большом числе клеток позвоночных животных. С использованием поли-линкера экспрессируемый ген помещают под контроль промоторов актинового гена цыплят или промотора цитомегаловируса (CMV), эффективное функционирование которых обеспечивает-
Энхансер CMV Промотор ^-активного гена цыплят
Рис. 14. Представители векторов, обеспечивающих экспрессию рекомбинантных генов в клетках животных
вектор рТпЕх™ широкого спектра действия, обеспечивающий кратко-
а
временную экспрессию генов; б - вектор того же семейства (рТпЕх), используемый для стабильной экспрессии рекомбинантных генов (Novagen, США)
Предыдущая << 1 .. 48 49 50 51 52 53 < 54 > 55 56 57 58 59 60 .. 221 >> Следующая
Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed