Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
5. Патрушев Л.И. Т. 1
129
ная последовательность в составе гибридного белка сохраняется, а колонка автоматически регенерируется. Если же рекомбинантный белок образует в бактериальных клетках тельца включения, его солюбилизируют 6 М мочевиной, наносят на колонку в 2 М мочевине, а элюирование производят либо энтерокиназой непосредственно в мочевине, либо в вышеупомянутых денатурирующих условиях. Один мл аффинного сорбента может связывать до 500 мкг рекомбинантного белка.
Ни пептид S-Tag, ни 103-звенный полипептид, используемый в качестве аффинного сорбента, не обладают ферментативной активностью, однако после образования комплекса в последнем индуцируется рибонуклеазная активность. Это позволяет количественно оценивать эффективность исследуемых систем экспрессии. Однако еще большей чувствительностью и удобством в применении обладают системы, в которых S-белок ковалентно связан с флуоресцентными красителями или ферментами (например, с классической пероксидазой хрена). Такую систему можно эффективно использовать для идентификации рекомбинантного белка с помощью вестерн-блоттинга и ее часто применяют одновременно со второй аффинной меткой.
Кальмодулин-связывающий пептид. Очистка гибридных белков, содержащих кальмодулин-связывающий пептид, была впервые описана в 1992 г. [169]. В ней используется 26-звенный пептид, заключенный в С-концевой последовательности киназы легкой цепи миозина скелетных мышц. Кальмодулин в присутствии ионов Са2+ обладает высоким сродством к этому пептиду. Прочность комплекса допускает промывку колонки при аффинной хроматографии в жестких условиях, что позволяет достигать высокой степени очистки целевого полипептида. Система особенно пригодна для очистки рекомбинантных белков из клеток Е. coli, поскольку их собственные белки не взаимодействуют с кальмодулином. При этом хроматографию можно проводить в присутствии восстанавливающих агентов и детергентов в концентрациях до 0,1%. Эта аффинная последовательность позволяет вводить радиоактивную метку с помощью у-[32Р] и протеинкиназы А, что используется для исследования белок-белковых взаимодействий [170]. Данную аффинную последовательность предпочтительнее вводить в С-конец исследуемого полипептида, поскольку его N-концевая локализация часто приводит к ингибированию трансляции.
Домены, связывающие целлюлозу. Известно более 13 семейств белков, обладающих доменами, связывающими целлюлозу (cellulose-binding domains - CBDs), размеры которых варьируют в пределах 4-20 кДа. Некоторые CBD необратимо взаимодей-
ствуют с целлюлозой и могут быть использованы для иммобилизации ферментов на соответствующем носителе [171]. Связь других CBD с целлюлозой менее прочная, и они находят применение для очистки и разделения гибридных белков, обладающих такой аффинной меткой. В частности, CBD класса I, обратимо связывающиеся с кристаллической целлюлозой, особенно пригодны для аффинной хроматографии [172]. Преимущества целлюлозы перед другими носителями заключаются в ее инертности, низком неспецифическом взаимодействии с биологическими макромолекулами, доступности в виде разнообразных форм и приложимости к созданию фармакологических препаратов. Обычно связь CBD с целлюлозой настолько прочная, что гибридный белок можно отделить от носителя только в присутствии денатурирующих агентов, что делает необходимым проведение рефординга элюированных белков для восстановления их биологической активности. В отличие от этого, рекомбинантные белки, содержащие CDB классов II и III, элюируются в мягких условиях этилен-гликолем, который, в свою очередь, может быть удален с помощью диализа [173]. Эффективная экспрессия гибридных белков, меченных CDB-доменами, происходит в прокариотических и эукариотических системах всех типов.
Стрептавидин-связывающий пептид SBP. Недавно полученный стрептавидин-связывающий пептид (streptavidin-binding peptide - SBP) образует прочный комплекс со стрептавидином с Kd ~2,5 нМ [174]. Рекомбинантные белки, содержащие такую С-концевую метку, эффективно экспрессируются в бактериальных клетках и могут быть очищены с помощью аффинной хроматографии из бесклеточных экстрактов [175].
Хитин-связывающий домен. Аффинная метка на основе хи-тин-связывающего домена Bacillus circulans [175] широко используется в сочетании с интеинами, что позволяет освобождать иммобилизованный на хитиновом носителе рекомбинантный белок в результате белкового аутосплайсинга (подробнее об интеинах см. раздел И. 1.3.2, а о применении хитиновых доменов в разделе II.3.2.1). Рекомбинантные белки, содержащие N-концевые или С-концевые хитиновые домены, ассоциированные с интеинами, эффективно синтезируются в бактериальных клетках [176, 177].
Глютатион-Э-трансфераза в качестве аффинной метки. Гибридные белки, содержащие в качестве аффинной метки последовательность глютатион-Б-трансферазы (GST), могут быть очищены хроматографией на колонках с иммобилизованным глютатионом [178]. Гибридные белки в большинстве случаев растворимы в водных растворах, существуют в них в виде диме-
