Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
нальные значения pH
антитела
S-Tag S-фрагмент Низкие 15 1,75 KETAAAKFER-
РНКазы А значения pH QHMDS
HAT (при Со2+-СМА Имидазол 19 2,31 KDHLIHNVH-
родная His- (Talon) 150 мМ или KEFHAHAHNK
последова низкие зна
тельность) чения pH
Кальмоду- Кальмоду- ЭГТА или 26 2,96 KRRWKKNFI-
лин-связы- лин ЭГТАс 1М AVSAANRFK-
вающий NaCl KISSSGAL
Пептид
Таблица 5 (окончание)
Аффинная Сорбент Условия Количе Моле Первичная
последова элюирования ство куляр структура
тельность остатков ная
масса,
кДа
Домен, Целлюлоза Семейство I: 27-189 3,0- Домены
связываю хлористый 20,00
щий гуанидин
целлюлозу или моче
вина >4 М.
Семейство
НДИ: эти-
ленгликоль
SBP Стрептави- Биотин, 38 4,03 MDEKTTGW-
дин 2 мМ RGGHVVEGL-
AGELEQLRA-
RLEHHPQGQ-
REP
Домен, Хитин Объедине 51 5,59 TNPGVSAWQ-
связываю ние с после VNTAYTAGQ-
щий хитин дователь LVTYNGKTY-
ностью ин- KCLQPHTSL-
теина: ди- AGWEPSNVP-
тиотреитол, ALWQLQ
30-50 мМ
Глюта- Глютатион Восстанов 211 26,00 Полипептид
тион-S- ленный
трансфе- глютатион,
раза 5-10 мМ
Белок, Амилоза Мальтоза, 396 40,00 Полипептид
связываю с попереч 10 мМ
щий ными
мальтозу сшивками
Все аффинные метки, составленные из аминокислотных последовательностей, можно разделить на две группы. К первой группе относятся небольшие пептиды, которые оказывают минимальное влияние на основной белок. Такие метки не иммуно-генны, и во многих случаях не возникает необходимости их удаления из гибридных полипептидов. Влияние коротких последовательностей на свойства основных полипептидов зависит от первичной структуры метки и положения в полипептидной цепи рекомбинантных белков [157]. Вторая группа аффинных меток включает большие пептиды или белки. Их использование способствует повышению растворимости основного белка, однако
часто возникает необходимость удаления метки перед дальнейшей работой с рекомбинантными белками, например, при проведении кристаллографических исследований или получении антител. В целом, трудно a priori принять решение об использовании конкретной метки, которое будет зависеть от свойств изучаемого белка (его стабильности, гидрофобности и т.п.), а также предполагаемого дальнейшего применения. В табл. 5 приведены сведения о наиболее часто используемых аффинных аминокислотных последовательностях.
Полиаргининовая система. Полиаргининовые аффинные метки обычно содержат 5-6 остатков Arg и добавляются к С-кон-цам белков, экспрессирующихся в бактериальных клетках. В сочетании с хроматографией на SP-сефадексе такие последовательности позволяют достигать 95% чистоты рекомбинантного белка и 44% выхода [158]. Метка может быть удалена с помощью карбоксипептидазы В. Система используется для иммобилизации функциональных белков на плоских поверхностях с целью изучения их взаимодействия с лигандами, а также на слюдяных подложках, обычно применяемых при электронной сканирующей микроскопии. В настоящее время применяется не очень часто.
Полигистидиновая система широко применяется для аффинной хроматографии белков на сорбентах с иммобилизованными ионами переходных металлов, включая Со2+, Ni2+, Cu2+, и Zn2+ (immobilized metal-affinity chromatography - IMAC). Функциональные группы имидазольного кольца His образуют с ионами прочные координационные связи. На таких колонках ионы Ni2+ удерживаются с помощью хелатного агента, например, иммобилизованной нитрилотриуксусной кислоты (NTА), которая обладает четырьмя валентностями, взаимодействующими с четырьмя из шести валентностей ионов металла. Оставшиеся две свободные валентности каждого иона взаимодействуют с биополимерами. При этом прочность связи зависит от длины поли(Шз)-последо-вательности в рекомбинантном белке. Элюирование связавшихся белков можно осуществлять с помощью имидазола как в мягких неденатурирующих условиях, так и в присутствии 6 М гуанидина или 8 М мочевины.
