Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Следует отметить также, что образование нерастворимых телец включения в бактериальных клетках в ряде случаев (например, при крупномасштабной наработке инсулина человека) является преимуществом, а не недостатком, поскольку тельца могут облегчать очистку рекомбинантных белков и защищать их от нротеолитической деградации.
Несмотря на определенные успехи в получении нативных рекомбинантных эукариотических белков в бактериальных клетках, эти системы экспрессии эукариотических генов в настоящее Бремя еще далеки от совершенства. По-прежнему остается открытым вопрос о посттрансляционных модификациях рекомби-
нантных белков в бактериях, а для многих рекомбинантных белков не решена даже проблема их внутриклеточной растворимости. С этой точки зрения идеальными системами экспрессии рекомбинантных эукариотических генов являются гомологичные генетические системы, т.е. сами эукариотические клетки животных или растений. Действительно, такие системы экспрессии, хотя и более дорогие, с успехом используются в биотехнологии. При этом одним из ключевых факторов, обеспечивающих эффективное функционирование подобных систем, могут быть эукариотические экспрессирующие векторы, основные особенности которых будут рассмотрены ниже в разделе 3.7.
3.6.6. Очистка рекомбинантных белков с использованием
аффинных аминокислотных последовательностей
Быстрое, и даже бурное развитие протеомики в последние несколько лет определяет интенсивное использование в исследовательской работе рекомбинантных белков. Естественно, работа с индивидуальными белками требует их эффективной очистки. Как всегда, любая задача может быть решена разными способами. Использование для быстрого выделения индивидуальных белков аффинной метки (affinity tag) в виде специфической аминокислотной последовательности, присоединенной к одному из концов исследуемого полипептида, позволяет просто и эффективно решать эту задачу [156]. Присоединение аффинных последовательностей проводят методами генной инженерии, объединяя в составе экспрессирующего вектора кодирующую часть исследуемого гена с последовательностью нуклеотидов того или иного пептида или полипептида, обладающего избирательным сродством к лиганду (табл. 5). В целом, системы очистки рекомбинантных белков, основанные на аффинных аминокислотных последовательностях, обладают целым рядом уникальных свойств. Так, они позволяют проводить выделение любого гибридного белка в один этап путем его адсорбции на соответствующем носителе. Сама аффинная метка оказывает минимальное влияние на третичную структуру основного белка и может быть легко удалена из гибридного полипептида. Кроме того, она допускает проведение быстрой и точной количественной оценки содержания белка в искусственных системах экспрессии рекомбинантных генов. Тем не менее использование каждой аффинной метки требует соблюдения конкретных условий, которые не являются универсальными и могут оказывать сильное влияние на биохимические свойства выделяемого белка.
Таблица 5
Свойства аффинных аминокислотных последовательностей, используемых в современной генной инженерии [156]
Моле
Аффинная Сорбент Условия Количе куляр Первичная
последова элюирования ство ная структура
тельность остатков масса,
кДа
II(WiH(Arg) Катионо- Линейный 5-6 0,80 RRRRR
обменные градиент (обыч
смолы NaCl (0- но 5)
400 мМ) при
щелочных
значениях
pH > 8,0
II(wiH(His) Ni2+-NTA, Имидазол, 2-10 0,84 НННННН
Со2+-СМА 20-250 мМ (обыч
(Talon) или низкие но 6)
значения pH
FLAG Монокло pH 3,0 или 2- 8 1,01 DYKDDDDK
нальные 5 мМ ЭДТА
антитела
анти-FLAG
3 х FLAG 22 2,73 DYKDHDGD-
YKDHDIDYK-
DDDDK
Strep-tag II Модифици 2,5 мМ 8 1,06 WSHPQFEK
рованный дестиобио-
стрептави- тин
дин Strep-
Tactin
c-myc Монокло Низкие 11 1,20 EQKLISEEDL
