Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Чем больше разбавление раствора антигена, тем ближе эта полоса располагается к его лунке и тем тоньше и четче сама полоса. Однако при чрезмерном разбавлении антигена осадок будет плохо заметен или не образуется вовсе, поэтому стараются подобрать оптимальное разбавление исходного раствора антигена. Для случая, иллюстрируемого рис. 29, таким разбавле-
}{& ппъ?пйл0ип
Г\ Г\
О о
о о
о о
1-8 1:4
Рис. 29. Двойная радиальная иммуно- Рис. 30. Картины преципитации при
диффузия (метод Ухтерлони) двойной радиальной иммунодиффузия
Цифры у периферических лунок — разбав- ДЛЯ РАЗЛИЧНЫХ антигенов И ИХ КОМбИ-
ление исходного раствора антигена наций В периферических лунках
нием будет I : 8. Если тонкая и четкая полоса преципитации оказывается расположенной слишком близко к лунке антигена, то следует увеличить разбавление антисыворотки и подобрать его так, чтобы полоса передвинулась примерно к середине расстояния между лунками антисыворотки и антигена.
При неудачном подборе соотношения исходных концентраций антигена и антисыворотки (если эти концентрации достаточно велики) могут наблюдаться артефакты образования нескольких полос преципитации за счет попеременного осаждения и растворения иммунных комплексов. В таком случае описанную выше операцию подбора разбавления раствора антигена следует повторить для ряда разбавлений антисыворотки, вносимой в центральную лунку.
На рис. 29 показано, что одиночные полосы преципитации плавно переходят одна в другую. Такая картина характерна для случая, когда во всех периферических лунках находятся растворы одного и того же антигена. Если же в эти лунки вносить разные антигены, а в полиспецифической антисыворотке содержатся антитела для каждого из них, то полосы преципитации уже не будут переходить одна в другую, но, образуясь независимо, будут пересекать друг друга (рис. 30).
Возможен случай образования пересекающихся полос при испытании нескольких антисывороток к одному чистому антигену (его помещают в центральную лунку). Причина этого состоит в полиспецифичности иммунного ответа. В разных антисыворотках антитела, «узнающие» один и тот же чистый антиген (по его разным антигенным детерминантам), могут быть представлены в различных пропорциях.
В периферических лунках могут испытываться различные смеси антигенов, например при обследовании процесса очистки •одного из них. Картина преципитации будет более сложной и может содержать несколько полос, часть из которых будет плавно переходить друг в друга, а часть — пересекаться (см. рис. 30).
Методом радиальной иммунодиффузии удобно характеризовать как чистоту раствора антигена, так и степень моноспецифичности антисыворотки (полноту очистки индивидуальных
антител). в
Описанная методика представляет собой микровариант метода Ухтерлони. Часто в качестве стекол для заливки геля ис~ пользуют предметные стекла микроскопа. В макрометоде, описанном самим Ухтерлони, гель заливают в чашки Петри на толщину 2—3 мм. Лунки и расстояния между НИМИ ДШЮТ 00|1Щ[*
соответственно увеличивают и объемы реагентов. Полосы преципитации видны лучше, но процесс диффузии занимает значительно больше времени.
Глава 2
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ БЕЛКОВЫХ ЗОН ПОСЛЕ ОБЫЧНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА И ИЭФ
ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ОБНАРУЖЕНИЕ АНТИГЕНОВ В САМОМ ГЕЛЕ
С помощью специфической антисыворотки можно идентифицировать полосу определенного антигена в геле агарозы или ПААГ после обычного электрофореза или ИЭФ. Простейший подход здесь сводится к вымачиванию геля в антисыворотке или растворе очищенных антител. Связываясь с антигенами, антитела увеличивают интенсивность последующей окраски соответствующих полос по сравнению с необработанным контрольным гелем. Кроме того, они могут осаждать антигены путем образования пространственной сетки, в то время как остальные белки остаются в растворе, поэтому их можно вымыть из геля. Разумеется, в тех случаях, когда электрофорез ведут в присутствии ДДС-Na, последний надо предварительно диссоциировать от белков и удалить из геля, поскольку он, как уже упоминалось, препятствует образованию иммунных комплексов. При этом белки приходится фиксировать в геле осаждением кислотой и спиртом, что весьма затрудняет операцию их последующего вымывания из геля.
Так, Олден н Ямада вскрывали клетки гомогенизацией в 2%-ном растворе-ДДС-Na. Электрофорез вели в 5%-ном ПААГ, также в присутствии ДДС-Na. Затем белки фиксировали кислотой и удаляли ДДС-Na либо длительными промывками изопропанолом в смеси с уксусной кислотой, либо путем вытеснения, также из раствора кислоты, с помощью Тритона Х-100. Оба варианта занимали много времени (4—5 сут). Затем гели переводили в нейтральный фосфатный буфер, содержащий 0,15 М NaCl (СФБ). Вырезанные вдоль геля полоски
(«треки») инкубировали с разбавленной тем же буфером антисывороткой во влажной камере в течение суток. Здесь не было необходимости заботиться об эквивалентном соотношении концентраций антител и антигенов, так как антитела взаимодействуют с разрыхленным при переводе в СФБ осадком антигена. Не связанные антителами белки вновь растворяли и вымывали из геля тремя сменами СФБ в течение 72 ч. Только после этого гель кратковременно вымачивали в 50%-ной ТХУ и окрашивали растворенным в ней красителем СВВ R-250 [Olden, Yamada, 1977].
