Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
разбавление антисыворотки) остается неизвестным. Если его необходимо определить, то подбор концентраций ведут в условиях смешивания двух растворов, наблюдая за выпадением преципитата по всему объему смеси.
В несколько пробирок наливают по 0,1 мл антисыворотки исходного, относительно небольшого разбавления. Затем в каждую пробирку приливают одинаковые объемы растворов антигена нарастающей концентрации, например от 20 мкг/мл и далее, удваивая концентрацию для каждой последующей пробирки. На этот раз содержимое пробирок взбалтывают и оставляют в термостате при 37°. Образование преципитатов обнаруживается по помутнению жидкости в некоторых пробирках. Отбирают одну или две пробирки, где преципитация выражена наиболее ярко. Теперь можно поварьировать концентрации антигена вблизи тех, которые были внесены в эти пробирки, с тем чтобы найти оптимум концентрации антигена. Иногда может оказаться необходимым взять другое начальное разбавление антисыворотки, чтобы изменение характера преципитации от пробирки к пробирке было более заметным.
По результатам такого подбора и устанавливают оптимальное соотношение разбавления антисыворотки и концентрации-антигена (или тоже разбавления его из исходного раствора, например в тех случаях, когда антиген содержится в некоей физиологической жидкости). Оптимальное соотношение в определенных пределах не должно зависеть от абсолютных значений разбавления антисыворотки и концентрации антигена. Подвигаясь описанным способом к максимальному разбавлению антисыворотки, при котором помутнение смеси растворов еще удается наблюдать, можно определить титр антител для этого варианта преципитации. Кстати, для упомянутого выше случая, когда раствор антигена представляет собой физиологическую жидкость с неизвестной абсолютной концентрацией антигена, последнюю тоже можно характеризовать максимальным разбавлением, при котором удается наблюдать преципитацию, и соответственно ввести понятие титра антигена (определяемого выбранным методом).
В специальных исследованиях определяли абсолютные концентрации обоих компонентов иммунного комплекса. При этом удалось показать, что молярное соотношение антитело/антиген в условиях эквивалентности концентраций зависит от размеров белковой молекулы антигена. Для рибонуклеазы (М=. 13 700) оно равно примерно двум, для пепсиногена (М=Л2 ООО) —трем, а для ^-глобулинов (М= 146 ООО) в оптимальных условиях с одной молекулой белка связывается в среднем 4—5 молекул антител. Очевидно, что это обусловлено наличием нескольких антигенных детерминантов на поверхности белка.
Гемагглютинация и гемолиз
Несравненно больше антигенных детерминантов, чем на белке, находится или может быть закреплено на поверхности целой клетки. Взаимодействие антител с этими поверхностными детерминантами, опять-таки в силу бивалентности антител, приводит к связыванию, или «агглютинации» клеток. Образование даже небольших клеточных агрегатов приводит к их быстрому и хорошо заметному осаждению из суспензии. Это обстоятельство позволило разработать столь же быстрый, как кольцевой тест, но на три порядка более чувствительный метод обнаружения антител в иммунной антисыворотке.
Для этой цели на поверхность промытых эритроцитов барана с помощью глютарового альдегида «сажают» в большом количестве молекулы белка-антигена. Их избыток в этом случае не опасен, так как они остаются связанными с клетками эритроцитов, а каждая такая клетка выступает в роли одиночного муль-тивалентного антигена. Выбор для этой цели именно эритроцитов связан с их окрашенностью, что облегчает наблюдение за осаждением агглютинатов. При смешивании разбавленной антисыворотки со взвесью таких эритроцитов даже ничтожной концентрации антител достаточно для возникновения заметной агглютинации. Она обнаруживает себя тем, что эритроциты не оседают на сферическое дно пробирки (или специальной лунки) в виде маленького сгустка, расположенного в центре полусферы, а выстилают ровным слоем всю ее поверхность.
Следует подчеркнуть, что антисыворотка должна быть свободна от комплемента. В противном случае произойдет вскрытие («гемолиз») эритроцитов. Белки комплемента не удаляют из сыворотки, а инактивируют нагреванием ее при 56° в течение 30 мин. Впрочем, можно поступать и прямо противоположным образом — судить о содержании в антисыворотке специфических антител по степени гемолиза, в присутствии комплемента, стандартной суспензии эритроцитов, «сенсибилизированных» посадкой молекул соответствующего антигена на их поверхность. Дело в том, что для литического действия комплемента на эритроцит не имеет значения, за счет какой иммунной реакции антитело связывается с его поверхностью. О степени гемолиза удобно судить по выходу гемоглобина в раствор, что легко оценить по оптической плотности этого раствора после удаления из него оставшихся целыми эритроцитов путем центрифугирования.
Реакция связывания комплемента
Участие комплемента в гемолизе эритроцитов можно использовать для определения концентрации антител (или антигенов) методом так называемой «реакции связывания комплемента». В этом случае нет нужды в посадке «рабочего» антигена на поверхность эритроцитов. Их используют в комплексе со своими, специфическими антителами, полученными из сыворотки друго-
