Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 66

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 60 61 62 63 64 65 < 66 > 67 68 69 70 71 72 .. 140 >> Следующая

Рис. 34. Идентификация одного из антигенов после иммуноэлектрофореза смеси (см, текст)
Наиболее интенсивные дуги преципитации видны во влажном геле и без окраски. Для получения более детальной картины иммунопреципитации гель окрашивают одним из используемых при обычном электрофорезе красителей для белков [Остерман, 1981]. Предварительно из геля удаляют непреципитиро-вавшие белки. Для этого его промывают несколько раз по 15 мин 0,1 М. NaCl. Одновременно из пластины геля постепенно отжимают влагу, накладывая на нее каждый раз один слой влажной и пять слоев сухой фильтровальной бумаги, которые прижимают стеклом с лежащим на нем грузом в 1 кГ. Наконец, гель сушат в струе теплого воздуха до состояния тонкой пленки и окрашивают, как описано в части I для ИЭФ в пластинах геля агарозы.
На рис. 35 представлена иммуноэлектрофореграмма белков человеческой сыворотки, полученная с помощью полиспецифи-ческой антисыворотки кролика к сыворотке человека. Можно заметить, что дуги преципитации в левой части рисунка вытянуты вдоль поля. Это указывает на совокупность нескольких белков, обладающих одинаковыми антигенными свойствами, но
разделяющихся при электрофорезе; в данном случае — это совокупность иммуноглобулинов.
Иммуноэлектрофорез очень широко используется в исследовательской практике. Среди недавних публикаций можно назвать, например, проверку полноты очистки фермента [Huchzer-meier et al., 1980] или выяснение иммунологического сходства двух ферментов [Gustafson, Milner, 1980].
Рис. 35. Иммуноэлектрофореграмма белков сыворотки крови человека, полу-
ченная с помощью полиспецифической антисыворотки кролика
2 мкл разбавленной вдвое сыворотки человека разделяли в течение 1 ч при напряженности поля 10 В/см н 10°; иммуноднффузия — в течение 15 ч
Для разделения антигенов вместо электрофореза можно воспользоваться ИЭФ. Такая замена описана еще в 1978 г. [Weiss et al., 1978]. В то время еще не выпускалась агароза со слабой способностью к эндосмосу, пригодная для ИЭФ. Авторы были вынуждены воспользоваться 4%-ным ПААГ, что приводило к значительному увеличению продолжительности иммунодиффу-зии (до 3 сут). Использование названных в части I специальных марок агарозы для ИЭФ делает иммуноэлектрофокусирование столь же доступным методом, как иммуноэлектрофорез. Впрочем, высокая разрешающая способность ИЭФ имеет в этом случае и оборотную сторону. Независимо от формы лунки белки будут фокусироваться в виде узких полос, поэтому дуги преципитации будут, очевидно, иметь менее удобную для расшифровки форму.
Глава 4
ЭЛЕКТРОИММУННЫЙ АНАЛИЗ ПО ЛОРЕЛЛУ
Это — количественный метод определения концентрации антигена [Laurell, 1966]. Раствор белка-антигена заливают в лунку, вырезанную на краю пластины геля агарозы с введенной в него антисывороткой. Под действием электрического поля белок мигрирует в этом геле. В ходе миграции образуются иммунные комплексы, связывающие антиген. Миграция продолжается до полного исчерпания антигена — по расстоянию миграции можно судить о его количестве. Это расстояние доступно наблюдению
благодаря образованию иммунопреципитата на переднем фронте миграции, как подробно описано ниже.
Стеклянную пластину заливают расплавленным 1%-ным раствором агарозы в 0,075 М Ыа-барбитуратном буфере (pH 8,6), содержащем 0,2—0Т6 мМ лактата кальция и 0,02% азида натрия, так чтобы получить слой геля толщиной 1 мм. Перед заливкой при 48—50° в раствор агарозы вносят антисыворотку до концентрации 0,5—10% по объему или соответственно меньшее количество очищенных антител и хорошо перемешивают. О подборе концентраций антисыворотки (и антигена) будет сказано ниже. Гель должен надежно пристать к стеклу, иначе антиген при электрофорезе будет мигрировать в слое свободной жидкости по зазору между стеклом и гелем. Ввиду этого имеет смысл предварительно нанести на подогретое стекло тонкий слой 1%-ного водного раствора агарозы, дать ему затвердеть, а потом высушить при 70°. Фирма «LKB» предлагает пластины из специально обработанного пластика, с которым гель агарозы связывается прочнее, чем со стеклом.
Размер пластины зависит от числа одновременно обследуемых препаратов или разбавлений одного препарата с учетом того, что по крайней мере четыре лунки надо предусмотреть для известных концентраций антигена, по которым можно будет построить калибровочную кривую. Таким образом, вдоль края пла* стины в геле вырезают не одну, а несколько цилиндрических лунок диаметром 3—4 мм, отстоящих Друг от друга на 8—10 мм и расположенных примерно на таком же, строго одинаковом для всех, расстоянии от края пластины. Лунки, как и ранее, вырезают по шаблону с помощью штампов с отсосом геля. У фирмы «LKB» такие шаблоны предназначены для тех же стандартных пластин размером 84X94 мм. Нередко для опытов используют стеклянные слайды размером 5X5 см.
В лунки вносят по 5—10 мкл растворов антигена, содержащих обычно от 0,5 до 5 мкг белка. Объемы жидкостей, вносимых во все лунки, должны быть одинаковыми. Сначала пластины помещают в прибор для горизонтального электрофореза, за-полняют тем же буфером электродные отсеки, накладывают фитили электродов так, чтобы катод был со стороны лунок, и выполняют все прочие подготовительные операции для электрофореза [Остерман, 1981]. Затем уже вносят растворы антигена в лунки и немедленно (во избежание простой иммунодиффузии) включают напряжение.
Предыдущая << 1 .. 60 61 62 63 64 65 < 66 > 67 68 69 70 71 72 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed