Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
После окончания электрофореза для освобождения от ДДС-Na пластину ПААГ вымачивают при комнатной температуре в течение часа в 0,15 М. Na-фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl и 0,5% Тритона Х-100. Затем гель кладут на стопку фильтров, смоченных тем же буфером, но без Тритона Х-100, с верхней поверхности геля фильтровальной бумагой удаляют избыток влаги, кладут на него диазобумагу, затем несколько слоев сухой фильтровальной бумаги «Whatman ЗММ», все это накрывают стеклом и прижимают грузом. За 1—2 ч при комнатной температуре, благодаря диффузии и вымыванию из геля поднимающимся вверх током жидкости («блоттинг»); часть белков из геля переходит на ДБМ-бумагу и связывается с ней в тех местах, которые лежат непосредственно над белковыми полосами в геле. Эта техника подробнее была описана при рассмотрении методов электрофореза [Остерман, 1981].
Затем следует насыщение неиспользованных диазогрупп, расположенных на участках между белковыми полосами. Для этого бумагу вымачивают 2 ч при 37° в 10%-ном растворе эта-ноламина в ОД М Трис-НС1 (pH 9) с 0,25% желатины. Этанола-мин по своей аминогруппе присоединяется ко всем оставшимся свободными диазогруппам бумаги и блокирует их.
Собственно иммунотестирование начинается тогда, когда полученную таким образом реплику белков геля на диазобумаге помещают в раствор специфической антисыворотки (например, в раствор с pH 7,4, содержащий 0,2 мг/мл IgG, 0,05 М Трис-НС1, ОД5 М NaCl, 5 мМ ЭДТА, 0,25% желатины и 0,05% NP-40) и осторожно покачивают в течение 12 ч при 37°. За это время завершается реакция связывания антител с фиксированными на бумаге антигенами (очевидно, что по крайней мере часть молекул антигенов не утратила своей иммунореактивности в результате фиксации на диазобумаге). Несвязавшийся IgG отмывают еще 12 ч при 37° тем же буфером. Здесь нет необходимости в эквивалентном соотношении концентраций, так как белки уже фиксированы на бумаге, так что антитела могут находиться в избытке.
Теперь для обнаружения оставшихся на бумаге антител, а следовательно, и локализации полос антигенов можно воспользоваться радиоактивно меченным (обычно 1251) белком А из оболочек бактерий Staphylococcus aureus. В гл. 1 было упомянуто, что этот белок обладает сродством к неизмененной части F0 большинства IgG. Некоторые подклассы иммуноглобулинов, например IgG 1 мыши, не связывают белок А, поэтому возможность связывания надо проверять. Радиоактивно меченный белок А доступен в виде готового препарата. Метку несложно
ввести и в лабораторных условиях, как описано в следующей части книги. Немеченный белок А поставляется, например, фирмой «Pharmacia». У связанных с антигенами молекул IgG неизменная часть F0 остается свободной и сохраняет способность присоединять белок А. Таким образом, радиоактивный белок А связывается с диазобумагой только в местах расположения полос антигенов.
Иммунную реплику на диазобумаге инкубируют 2 ч при 37° в растворе |251-белка А (около 106 имп-/мин в 1 мл). Затем тща-тельно отмывают водой и снимают неспецифически сорбировав-шийся белок А двукратной промывкой (по 2 ч) при 37° крепким солевым раствором с детергентом (1 М NaCI, 0,4% саркозила, 0,05 М. Трис-НС1, 5 мМ ЭДТА, pH 7,4). Наконец, бумагу еще раз споласкивают водой, сушат и положение полос антигена локализуют методом авторадиографии с интенсифицирующим экраном (см. часть III).
Описанный метод был успешно использован для выяснения иммунологической близости РНК-полимераз I и II из цветной капусты. IgG очищали из антисыворотки кролика, иммунизированного РНК-полимеразой II. Электрофорезу в параллельных треках смешанного геля ПААГ-агарозы подвергали очищенные препараты обеих РНК-полимераз. В обоих ферментах были обнаружены иммуно-родственные субъединицы [Guilfoyle, 1980].
Аналогичный прием был использован недавно Саймингтоном и соавторами. Однако перенос белков из геля на диазобумагу они осуществляли не за счет вымывания, а электрофоретиче-ски — под действием электрического поля, приложенного в поперечном направлении, как было описано при обсуждении электрофореза. Авторы отмечают, что IgG и меченый белок А можно снять с реплики путем обработки ее в течение 30 мин при 60° раствором, содержащим 2% ДДС-Na и 0,1% [i-меркаптоэтанола в 0,05 М. фосфатном буфере, pH 7,5. Белки, закрепленные на диазобумаге, не теряют при этом своей реакционной способности, так что после соответствующей промывки бумаги их можно тестировать антисывороткой другой специфичности [Symington et al., 1981].
Еще более высокой избирательностью отличается постановка эксперимента в работе Эрлиха и соавторов. Они ввели еще одну ступень отбора антигенов. На ДБМ-бумагу из геля переводили не все белки, а преимущественно специфические антигены. С этой целью к диазобумаге предварительно присоединяли антитела к этим антигенам, точнее их фрагменты, содержащие оба центра связывания антигенов, но лишенные неизменной части Fc. В гл. 1 такие фрагменты были обозначены F(eB,h. Для их получения частично очищенную антисыворотку диализом переводили в ОД М CHsCOONa (pH 4,3) и в этом растворе обрабатывали пепсином (0,4 мг/мл) в течение 8 ч при 37°. «Отрезанные» таким образом фрагменты F/ задерживали на им-
