Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
го животного путем его иммунизации эритроцитами барана. Такой комплекс образуют заблаговременно и, разумеется, в отсутствие комплемента. При контакте с комплементом из любого источника (напомним, что белки комплемента неспецифичны) эритроциты будут немедленно разрушаться — пойдет гемолиз. Но содержание комплемента в некоем рабочем растворе можно поставить в зависимость от концентрации в нем иммунных комплексов антиген — антитело, причем уже не имеющих никакого отношения к эритроцитам. Содержание комплемента в рабочем растворе надо подобрать так, чтобы он был в недостатке. Тогда чем больше его свяжется с находящимися в растворе иммунными комплексами, образованными исследуемыми антителами и антигенами, тем менее полно пройдет гемолиз стандартной суспензии сенсибилизированных эритроцитов. Существенно, что при этом нет нужды в образовании пространственной сетки из молекул антител и антигенов, а следовательно, в определенном соотношении концентраций тех и других молекул. В принципе успех реакции не зависит и от абсолютных значений этих концентраций — они могут быть очень малыми. Все это обусловлено тем, что связывание комплемента протекает для каждого индивидуального иммунного комплекса антиген — антитело независимо от существования других таких комплексов.
Судить об уменьшении степени гемолиза стандартной суспензии эритроцитов можно по снижению (по сравнению с контролем) оптической плотности выходящего в раствор гемоглобина. Это снижение путем построения соответствующих калибровочных кривых можно связать либо с количеством вносимых в раствор антигенов при условии, что специфические к ним антитела в этом растворе имеются в избытке, либо с количеством вносимых антител в случае избытка антигенов. Для реакции связывания комплемента нет нужды выделять и очищать образующие комплемент белки. Достаточно воспользоваться нормальной сывороткой неиммунизированного животного. Такую сыворотку можно хранить в лиофилизированном или замороженном виде при —20°, но не просто на холоду, так как при длительном хранении сыворотки даже вблизи нулевой температуры комплемент постепенно инактивируется. Чаще всего используют сыворотку крови морской свинки (продажный препарат).
Микрореакция связывания комплемента была отработана еще 20 лет назад Вассерманом и Левином и с тех пор используется без существенных изменений. Например, для определения концентрации некоего антигена поступают следующим образом. В ряд пробирок разливают по 0,3 мл буфера, содержащего 5 мМ барбитуровой кислоты, 0,15 М NaCl, 0,5 мМ MgCl2, 0,15 мМ СаС12 и 0,1 % желатины. Затем туда же вносят по 0,1 мл соответственно (см. ниже) разбавленной антисыворотки к исследуемому антигену и (для построения калибровочной кривой) по 0,1 мл различных разбавлений исходного раствора самого
этого антигена. Затем в качестве источника комплемента в пробирки добавляют по 0,1 мл 0,4%-ного раствора лиофилизирован-ной сыворотки морской свинки и инкубируют при 4° в течение 18 ч. Этого достаточно для полного завершения реакции образования иммунных комплексов и максимального связывания с ними комплемента. Наконец, в пробирки вносят по 0,1 мл суспензии сенсибилизированных, как описано выше, эритроцитов барана (продажный препарат) в концентрации примерно 5ХЮ1 кл/мл. Гемолиз завершается в течение часа при температуре 35°. Нелизированные эритроциты удаляют центрифугированием на холоду и измеряют оптическую плотность супернатанта при 413 нм (Л413). В контрольную пробирку антитела и антиген не вносят.
Концентрацию раствора сыворотки морской свинки и суспензию эритроцитов подбирают так, чтобы уже в контрольной пробирке комплемент был в некотором недостатке и гемолиз эритроцитов проходил менее чем на 100%. В рабочих пробирках гемолиз будет еще менее полным за счет связывания части молекул комплемента исследуемым иммунным комплексом. Разбавление антисыворотки надо выбрать так, чтобы концентрация антител была заведомо избыточной (не вЛияла на степень связывания комплемента), а калибровочную кривую следует строить как зависимость уменьшения поглощения гемолизата (А Л413) от концентрации раствора антигена. Количество антигена следует брать минимальным, с тем чтобы оставаться заведомо далеко от эквивалентного соотношения концентраций антигена и антител, когда образование пространственной сетки мешает связыванию комплемента. С помощью калибровочной кривой при точно такой же постановке эксперимента можно определить концентрацию антигена в исследуемом растворе, испробовав несколько его разбавлений и используя для измерений линейный участок кривой [Wasserman, Levine, 1961; KHnkert et al., 1980; Krajewska et al., 1980].
Точно так же, но при обратном соотношении компонентов иммунного комплекса производят определение концентрации антител.
Чувствительность методов прямой преципитации комплексов антиген — антитело и методов с участием эритроцитов и комплемента трудно даже сравнивать. Если первые позволяют обнаруживать антитела при концентрации не менее 20 мкг/мл, то ге-магглютинация и гемолиз позволяют снизить порог чувствительности до 0,01 мкг/мл, а метод связывания комплемента — до 0,1 мкг/мл. Однако следует иметь в виду, что высокочувствительные количественные методы по своему существу (очень малые концентрации антител) не могут быть столь же быстрыми, как преципитация, и требуют многих часов для проведения соответствующих экспериментов. Если учесть, что концентрация специфических антител в антисыворотке при успешной иммунизации достигает 10 мг/мл, то ясно, что даже относительно низ-
