Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Очевидно, что для образования такого осадка (преципитации) концентрация обоих компонентов смеси должна быть достаточной. Менее очевидно, но легко понять, что и соотношение
их концентраций должно лежать в определенных границах. Действительно, если окажется, что антигены в растворе находятся в значительном избытке по отношению к антителам, то на долю каждого антитела заведомо достанется по два отдельных антигена и сетка не образуется (рис. 28, б). И наоборот, если в большом избытке будут антитела, то образование пространственной сетки окажется невозможным из-за нехватки связующих антигенов (рис. 28, в). Таким образом, даже при достаточной
б
%>-$
Рис. 28. Образование пространственной сетки молекул антител и антигенов (обозначены кружками)
а — эквивалентная концентрация; 6 — избыток антигенов; в — избыток антител
концентрации в растворе антигенов и антител их соотношение должно быть близко к оптимальному. Это соотношение, точнее некая область приемлемых для образования пространственной сетки соотношений концентраций антител и антигенов, называется «областью эквивалентности концентраций». Понимание необходимости такой эквивалентности очень существенно для дальнейшего изложения. Преципитация успешнее всего протекает вблизи нейтральных значений pH. При рНс.4,5 и рН> >10 преципитаты растворяются в результате диссоциации иммунных комплексов3.
Кольцевой тест
Простейшим, хотя и далеко не самым чувствительным, методом обнаружения в сыворотке крови иммунизированного животного специфических антител может служить так называемый «кольцевой тест». В нем как раз и используется явление преципитации пространственной сетки антигенов и антител.
Эквивалентное соотношение концентраций устанавливается за счет диффузии вблизи границы соприкосновения растворов антител и антигенов. В пробирку диаметром 3—4 мм наливают 0,1—0,2 мл антисыворотки. Если есть основание предполагать,
3 Преципитацию иммунных комплексов можно стимулировать полиэтиленгли-колем. Например, после инкубации в течение 1,5 ч при комнаткой темпера* туре с 2,5% ПЭГ-6000 иммунные комплексы осаждают центрифугированием (2000 g, 10 мин) из раствора со стократным соотношением количества антигенов и антител при суммарной их концентрации 50 мкг/мл [Maidment et al., 1981]. По-видимому, в этом случае осаждение комплексов идет за счет обычной агрегации, а не путем образования пространственной сетки.
что в ней уже содержится много антител, то сыворотку разбавляют в 5—10 раз физиологическим раствором. Туда же можно добавить несколько кристалликов сахарозы, для того чтобы увеличить плотность раствора. Затем, наклонив пробирку, на сыворотку осторожно наслаивают примерно 0,5 мл раствора антигена. Нужно заранее подготовить несколько растворов антигена различной концентрации, проварьировав ее в достаточно широ^ ком диапазоне, например от 1 мкг/мл до 1 мг/мл, и столько же пробирок с антисывороткой.
Установив пробирки в штатив, наблюдают на темном фоне при боковом освещении образование мутно-белых колец преципитата. Кольца появляются в результате диффузии антител из сыворотки в раствор антигена — там, где создается эквивалентное соотношение концентраций, причем и абсолютные значения концентраций оказываются достаточными для образования пространственной сетки. Эти концентрации задаются разбавлением раствора антигена. Обычно кольца преципитатов образуются в пределах 20 мин. Если они не появляются в течение 2 ч, то это указывает либо на отсутствие или слишком малое содержание специфических антител в сыворотке, либо на неудачный выбор концентрации раствора антигена. Если в некоторых пробирках кольца преципитации появляются, то для количественных оценок следует приготовить серию дальнейших разбавлений антисыворотки, а для каждого из этих разбавлений новую серию разведений антигена, ориентируясь при этом на то соотношение их концентраций, при котором исходно наблюдалось появление колец.
Предельное разбавление антисыворотки, при котором еще удается наблюдать кольца преципитации (при подобранной оптимальной концентрации раствора антигена), характеризует содержание специфических антител в сыворотке; это разбавление называют «титром» антител. Таким образом, указание на то, что титр антител в антисыворотке равен 1000, означает, что при разбавлении антисыворотки крови иммунизированного животного в тысячу раз данный метод в указанных условиях позволяет обнаружить эти антитела по образованию колец преципитации. Очевидно, что эта характеристика — не строго количественная, ведь из нее нельзя вычислить количество микрограммов антител, содержащееся в одном миллилитре сыворотки. Однако для целей наблюдения за ходом развития иммунного ответа метод вполне пригоден. Из изложенного следует также и то, что указание титра антител в антисыворотке не имеет смысла без уточнения метода, которым этот титр определялся.
Определение соотношения эквивалентности
В описанном кольцевом тесте зона эквивалентности концентраций антител и антигена образуется за счет диффузии, и само это отношение концентраций (хотя бы выраженное через
