Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
муносорбенте, несущем белок А, закрепленный на сефарозе («Protein A Sepharose 4В»—продажный препарат).
Неиспользованные после «посадки» F<eB,)z диазогруппы бумаги блокировали обработкой глицином и бычьим сывороточным альбумином. Когда после электрофореза белки из геля описанным выше приемом «блоттинга» переносили на диазобумагу, они уже не встречали свободных диазогрупп. Большинство из них, не задержавшись на бумаге, следовало дальше в лежащие сверху фильтры. Только антигены для закрепленных на диазобумаге
Рис. 31. Четырехслойная система обнаружения полос антигена с помощью реплики на диазобумаге
1 — диазобумага; 2 — фрагмент F(ab')*’ 3 — антиген; 4 — антитело; 5 — [Х2Ч]~ белок А
F(aB.^-фрагментов оставались на бумаге, образуя иммунные комплексы* Затем диазобумагу еще раз обрабатывали той же самой иммунной сывороткой, но на этот раз полноценной, содержащей целые молекулы IgG. Эти молекулы по второму антигенному детерминанту связывались с белками-антигенами, «сидящими» на фрагментах F(aB,)aJ т. е. только на участках реплики, соответствующих первоначальному расположению полос антигена в геле. Прямая связь вторичных антител с диазобумагой осуществиться не может, так как все диазогруппы уже заняты или заблокированы. Но этот второй слой антител приносит свои Рс-фрагмен-ты, а на них можно посадить радиоактивно меченный белок А, подобно тому как это было описано в предыдущем опыте. Получается сложный «сэндвич» (рис. 31). При образовании такого сэндвича специфическое «узнавание» антигена антителами происходит на двух этапах, что повышает степень избирательности. Метод легко обнаруживает 1СН* мкг белка-антигена в полосе. С его помощью авторам удалось обнаружить редуктазу дигидро-фолиевой кислоты мыши, продуцируемую в клетках Е. coli, несущих плазмиду с встроенным в нее соответствующим геном, причем уровень синтеза этой редуктазы не превышал 0,01% от уровня суммарного белкового синтеза в бактерии [Erlich et alM 1979].
Для облегчения перехода белков из геля на диазобумагу Ренарт и соавторы проводили электрофорез в растворимом ПААГ, сшитом диаллилтартардиамидом или этилендиакрила-том, полнмеризуя его совместно с 1%-ной агарозой. Перед наложением диазобумаги ПААГ растворяли обработкой йодной кислотой или щелочью [Остерман, 1981]. Благодаря агарозе
i
пластина геля сохраняла свою форму, а выход белков из раство-ренного ПААГ через крупные поры агарозы заметно ускорялся [Renart et al., 1979].
Реплика на нитроцеллюлозном фильтре
Таубин и соавторы электрофоретически переводили белки из ПААГ на нитроделлюлозный фильтр типа «Millipore» и там их обнаруживали иммунохимически [Towbin et al.} 1979]. Для этого оставшиеся свободными центры сорбции нитроцеллюлозы сначала насыщали обработкой 3%-ным раствором БСА, а потом уже инкубировали с антисывороткой к интересующему белку. Иммунные комплексы на фильтре в этой работе обнаруживали с помощью радиоактивно меченных вторичных антител к иммуноглобулинам первого слоя (метод двух антител), а также конъюгированных с ферментами и флюоресцентно меченных антител (см. ниже,).
Недавно было показано, что после двумерного фракционирования 0,2 мг смеси белков по методу 0/Фаррелла, выявившего около 400 пятен, описанный только что перенос можно осуществить последовательно на три нитроцеллюлозных фильтра, если силу тока переноса ограничить 300 мА, а продолжительность— одним часом. После обработки фильтров первичными антителами иммунные комплексы обнаруживали с помощью радиоактивно меченного белка А. При этом также использовали возможность снятия антител для последующей повторной обработки фильтра антисывороткой другой специфичности, однако вместо ДДС-Na для этой цели применили вымачивание фильтра в течение 1,5 ч при комнатной температуре в кислой среде: 0,1 М глицин-HCl (pH 2,2) с 50 мМ КС1 и 20 мМ (CH3COO)2Mg. Фиксированные на нитроцеллюлозе антигены при этом не утрачивали своих иммунохимических свойств [Legocki, Verma, 1981].
Существенный недостаток нитроцеллюлозных фильтров при получении иммунных реплик—избирательный характер сорбции белков на этих фильтрах. Основные белки, как правило, сорбируются ими хорошо, а кислые иногда практически не сорбируются. Ввиду этого важного обстоятельства предпочтение следует отдать использованию диазобумаги. Кстати, отмеченная в последней работе возможность снятия нескольких реплик с одного геля, по-видимому, сохраняется и для этого варианта.
Следующий любопытный экспериментальный прием [Daus-sant, Mac Gregor, 1979] можно в какой-то мере рассматривать как процедуру, обратную описанным выше. В этой работе за счет иммунопреципитации антигены избирательно задерживали на кусочке обычной фильтровальной бумаги в процессе нанесения препарата на ПААГ для ИЭФ. Квадратик бумаги «Whatman» № I» вымачивали в растворе очищенного IgG (2 мг/мл в 0,0175 М К~фосфатном буфере, pH 6,55) и клали на гель, а поверх него помещали кусочек такой же бумаги чуть меньшего
размера, смоченный раствором исследуемого белкового препарата. В параллельный трек вносили тот же препарат, но через бумажку, смоченную просто фосфатным буфером. После окончания ИЭФ и окрашивания белков сопоставляли наборы полос в двух соседних треках. «Лишние» полосы в контрольном треке, очевидно, принадлежали антигенам.
