Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Разработанный Кёлером и Мйльштейном метод немедленно-получил широкое признание; в последние годы работы с исполь*
зованием гибридом появляются одна за другой. Для более подробной иллюстрации применяемой сейчас техники процитируем одну из них.
Катцман и соавторы получали моноклональные антитела к одному из белковых факторов коагуляции крови («фактор V») [Katzmann et al.* 1981]. Мышей линии BALB/c иммунизировали, вводя им внутрибрюшинно 125 мкг фак-тора V, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда, Через 10 дней так же вводили еще 125 мкг фактора V, на этот раз в солефосфатном буфере. Еще через 3 дня мышей забивали, стерильно извлекали селезенку и диспергировали ее клетки в питательной среде с добавлением до 10% сыворотки зародыша теленка. 108 клеток этой суспензии смешивали с 107 клеток культуры миеломы мыши (линия NS-1). Смесь осаждали центрифугированием и промывали питательной средой без сыворотки. К осадку клеток добавляли 1 мл 50%-ного раствора полиэтилен гликоля (ПЭГ-1500) в той же среде (иногда используют смесь, содержащую 47% ПЭГ и 7,5% диметилсульфоксида [Borrebaeck, Etzler, 1981]).
В присутствии ПЭГ происходит соматическая гибридизация некоторой (небольшой) части клеток. В этом процессе важно строго следовать жесткому режиму времени соответствующих обработок, С 50%-ным раствором ПЭГ клетки инкубировали 1 мин при 37°. Затем добавляли еще 1 мл среды и осторожно перемешивали густую суспензию. Еще через 5 мин добавляли 20 мл той же среды и клетки собирали центрифугированием. Супернатант отсасывали и клетки осторожно суспендировали в 48 мл питательной среды с добавлением 10% сыворотки теленка, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и до 2 мМ глютамина. Суспензию разливали в две платы (по 24 лунки в каждой), куда вносили еще по 5ХЮ5 вспомогательных перитонеальных клеток («feeder cells*).
Через день инкубации начинали постепенный перевод клеток в селективную среду для отбора гибридом. С этой целью из каждой лунки удаляли по 1 мл указанной питательной среды и вносили на ее место по 1 мл точно такой же среды, но содержащей еще 0,1 мМ гипоксантина, 0,4 мкМ аминоптерина и 16 мкМ тимидина (HAT-среда). Эту операцию повторяли через каждые 3 дня в течение 18 дней, постепенно заменяя тем самым нормальную питательную среду на селективную, в которой размножаться могут только гибридные клетки.
Далеко не все из них являются гибридомами-продуцентами нужных антител (популяция клеток селезенки состоит не только из плазмацитов), поэтому далее следовало сканирование всех лунок на наличие в их питательной среде антител к фактору V, что служило указанием на присутствие нужных гибридом. Сканирование производили методом радиоиммунного тестирования на твердой фазе. Подробно он рассмотрен в части III данной книги. Вкратце операции сканирования сводились к следующему. На поверхности пластинки из пластмассы (полистирола или полихлорвинила) сорбировали мономолекулярный слой антигена (фактора V) и осуществляли контакт этой пластинки одновременно со всеми лунками. Из тех лунок, где содержатся соответствующие антитела, последние частично переходили на пластину, связываясь с сорбированными на ней антигенами. Это можно было обнаружить, обрабатывая пластинку раствором радиоактивно меченных вторичных антител, например антисывороткой кролика против иммуноглобулинов мыши. Завершала сканирование авторадиография или просчет кусочков соответственно разрезанной пластинки
4
Рис* 27, Радиоиммунное сканирование для отбора гибридбм, продуцирующих специфические антитела
/ — пластмассовая пластина, несуща я конусы с отверстиями; 2— молекулы антигена; 3 — иммунологическая плата с лунками; 4 — гибридомы; 5 — антитела; а — пластаны, заполненные раствором антигена; б — антигены, сорбированные на поверхности пластмассы; в—погружение конусов в лунки и заполнение их питательной средой гибридбм с находящимися в ней антителами; г—антитела, связавшиеся с антигенами на поверхностях конусов
В каждой из отобранных таким образом лунок еще содержалось около 200 ООО клеток. В силу полиспецифичности иммунного ответа (см, выше) они еще не были моноклональны, поэтому далее клетки из этих лунок рассеивали по одной, выращивали колонии и снова их сканировали, т. е, производили обычные операции клонирования, позволяющие в конце концов отобрать наилучший по заданным параметрам клон гибридом, образующих совершенно одинаковые* «моноклональные» антитела. Моноклональные гибридомы в суспензии вырабатывают 5—10 мкг антител на 1 мл среды. Однако полученные от чистых линий BALB гибридомы сохраняют присущую миеломным клеткам способность к опухолевому росту. Ими инокулируют мышей и после нескольких пассажей полу* чают в асцитной жидкости моноклональные антитела в огромном количестве — до 50 мг чистых антител на мышь (титр 10е—Ю7).
Упомянутую пластину для твердофазного радиоиммунного сканирования удобно изготовить с таким же, как у лунок, рас-положением конусов с малыми отверстиями (рис. 27, а). При внесении в них раствора тестирующих антигенов из-за гидро-фобности пластика он через дырочки не выливается. Антигены сорбируются на стенках конусов, и жидкость, перевернув пластинку, можно просто стряхнуть (рис. 27, б). Затем конусы погружают в лунки. Питательная среда гибридом, содержащая
