Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Препарат белков вносят в лунку микрошприцом на 2—10 мкл до ее заполнения. Суммарное количество белка в препарате может варьировать в широких пределах (1 —100 мкг) в зависимости от гетерогенности белковой смеси и эффективности образования иммунопреципитатов каждым из антигенов, входящих в ее состав. Это количество приходится подбирать в пробных экспериментах.
Затем проводят электрофорез в горизонтальной пластине геля, используя для этой цели один из приборов, описанных ранее [Остерман, 1981]. Положение геля можно фиксировать на охлаждающем столике прибора с помощью липкой ленты. Фитили электродов накладывают на гель, а полярность напряжения выбирают так, чтобы катод был со стороны лунки с препаратом. В качестве электродного обычно используют тот же буфер, что и в самом геле. При напряженности поля 10 В/см и температуре охлаждающей жидкости 10° электрофорез в геле агарозы занимает обычно 1—2 ч.
Затем следует этап иммунодиффузии и образования дуг преципитатов. Пластину с гелем вынимают из прибора и выскребают шпателем агарозу из канавок. Туда до уровня геля заливают разбавленную антисыворотку (степень разбавления, как указывалось, приходится подбирать). Если есть опасение, что гель агарозы неплотно прилегает к стеклу и антисыворотка может подтекать, на дне канавки следует предварительно образовать тонкий слой геля агарозы. После этого пластину оставляют во влажной камере на 10—20 ч.
За это время в свободные полоски геля по обе стороны от трека идет диффузия всех участвующих в электрофорезе белков из их конечных положений в геле. Благодаря круглой форме белковых пятен эта диффузия идет строго радиально и одинаков во во всех направлениях. Навстречу им из канавок, расположенных обычно по обе стороны от трека белков, в ту же свободную полосу геля диффундируют все компоненты антисыворотки. Эта диффузия идет фронтально, одновременно (хотя и с неодинаковой скоростью) для всех антител, входящих в состав полифунк-циональной антисыворотки. Молекулы различных антигенов
О
О
О
О
О
О
О
О
о
о
о
о
о
о
о
Рис. 32. Шаблон для вырезания лунок и канавок, используемый при иммуноэлектрофорезе в геле по Грабар и Уильямс
встречаются со своими специфическими антителами против тех мест вдоль пластины геля, куда каждый из антигенов мигрировал в ходе предшествовавшего электрофореза. Там, где при такой встрече реализуется эквивалентное соотношение концентраций, а сами эти концентрации достаточны, идет образование полос рреципитации иммунных комплексов, как это описано для метода Ухтерлони*
В данном случае полосы преципитации всегда имеют форму дуг, вогнутых в сторону белковых пятен и искривленных тем сильнее, чем ближе к пятну белка располагается полоса. Это расположение зависит от концентраций антигена в пятне и специфических для него антител в антисыворотке, а также от соотношения скоростей их диффузии в геле. Легко понять, что дуги преципитации должны быть неодинаковы по толщине, причем в двояком смысле этого утверждения. Во-первых, разные дуги могут существенно отличаться друг от друга по интенсивности, т. е. по обилию преципитатов. Это обусловлено различием концентраций антигенов в исходном препарате и антител в поли-специфической антисыворотке. Во-вторых, каждая из дуг окажется наиболее толстой в середине, а к концам ее толщина будет плавно уменьшаться (рис. 33). Причина этого состоит в том, что при радиальной диффузии концентрация антигена в геле уменьшается по мере удаления от исходного пятна, а его встреча с антителами будет происходить раньше всего в направлении, перпендикулярном к канавке, где и будет располагаться середина симметричной дуги преципитации. Положение концов этой дуги будет отвечать такому удалению от белкового пятна, когда эквивалентному соотношению концентраций антител и антигена отвечают столь малые абсолютные значения этих концентра-ций, что преципитат уже не может образоваться.
©
Рис. 33. Дуги преципитации иммунных комплексов после иммуноэлектрофореза смеси антигенов
В обе канавки внесена одна и та же полиспецнфическая антисыворотка
На рис. 33 изображены две канавки, расположенные симметрично по обе стороны трека белков и заполненные одной и той же антисывороткой. В большинстве случаев так и поступают. Симметричная картина расположения дуг преципитации увеличивает надежность расшифровки результатов опыта. Впрочем, расшифровка в этом случае не означает определение содержа-
ния или характера миграции при электрофорезе определенного антигена. Она может быть полезной в сравнительных опытах для обнаружения отклонений от нормальной и хорошо изученной картины совокупности дуг преципитации, например для сыворотки крови или спинномозговой жидкости.
Для идентификации дуги преципитации, относящейся к определенному антигену, можно воспользоваться приемом, кото* рый иллюстрирует рис. 34. Полиспецифическую антисыворотку вносят в одну канавку, расположенную между двумя электрофоретическими треками. В одном из этих треков фракционируют исследуемую смесь антигенов, а во втором — проводят электрофорез чистого препарата искомого антигена. Теперь, опираясь на симметрию, можно среди суперпозиции дуг исследуемого препарата отыскать ту, которая обязана своим появлением наличию в препарате того же самого антигена. Кстати, суперпозиция и сложная порой картина взаимного пересечения дуг преципитации не должна вызывать недоумения, поскольку, как это уже отмечалось при обсуждении метода Ухтерлони, каждый из антигенов диффундирует и образует иммунные комплексы независимо от других. То же самое относится и к диффузии антител. Имеются и другие варианты использования описанного метода иммуноэлектрофореза.
