Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Более высокую чувствительность дает процедура двухступенчатой иммунохимической обработки. Дион и соавторы недавно использовали ее для установления иммунологического сходства одного из белков женского молока с основным гликопротеидом оболочки вируса рака молочной железы мыши.
Белки молока фракционировали электрофорезом в ПААГ по методу Лэм-:мли после обработки их ДДС-Na. В этом случае также проводили отмывку ДДС-Na, но сравнительно кратковременную — в течение ночи смесью метанол — СНзСООН — вода (50 : 7,5 : 42,5). Белки при этом осаждались. Затем гель переводили в СФБ (pH 7,4). Указанная отмывка не удаляет ДДС-Na полностью, что снижает интенсивность первичной иммунной реакции, однако благодаря использованию двухступенчатой системы чувствительность в целом получается высокой.
Сначала гель инкубировали в течение ночи при 37° с разбавленной (1 : 10) ¦тем же буфером антисывороткой козы против сопоставляемого вирусного гликопротеида. Затем не связавшуюся антисыворотку н все прочие белки молока растворяли и вымывали из геля с помощью СФБ в течение 3 сут, После этого гель инкубировали в течение 1,5 ч при 37° в растворе продажной антисьгворот-ки кролика против иммуноглобулинов козы. Снова отмывали его от несвязав-шейся сыворотки и белковые зоны окрашивали как обычно [Dion et al., 1980].
В этом варианте с белками зоны антигена сначала связываются специфические антитела сыворотки козы» а затем на них «вторым слоем» садятся антитела антисыворотки кролика. Последние «узнают» невариабильную часть (Fc) любого антитела сыворотки козы, поэтому то обстоятельство, что эти антитела своими вариабильными участками (FaB) связаны со специфическими антигенами, не мешает «узнаванию». Такую постановку эксперимента можно назвать «методом двух антител». Она широко используется в радиоиммунных методах исследования (см. часть III).
ПОЛУЧЕНИЕ ИММУННЫХ «РЕПЛИК»
Высокая чувствительность иммунохимических методов позволяет идентифицировать зоны антигена в геле, не связывая весь белок с антителами специфической антисыворотки. Для этой цели достаточно после окончания электрофореза или ИЭФ получить иммунную «реплику» с геля.
Агарозная реплика
На строго горизонтальную поверхность пластины ПААГ быстро выливают расплавленный 0,5%-ный раствор агарозы в СФБ, чтобы получить слой толщиной 1 мм. Предварительно агарозу смешивают при 56° с разбавленной специфической антисывороткой. После застывания геля агарозы такую двуслойную пластину выдерживают при 37° во влажной камере 2—6 ч, в зависимости от размера молекул антигена, диффундирующих из ПААГ в агарозу. Затем, отметив на пленке агарозы положение лидирующего красителя в рабочем ПААГ, ее снимают, покачивая пластинку в СФБ. Пленка агарозного геля легко отделяется от ПААГ. Одновременно с диффузией в гель агарозы идет им-мунохимическая реакция антигенов с находящимися в геле антителами и образование преципитатов. Пленку вымачивают в течение 4 ч в том же буфере, удаляя из нее не прореагировавшие иммуноглобулины антисыворотки и белки неантигенной природы, перешедшие туда из ПААГ. Преципитировавшие иммунные комплексы с участием искомого антигена можно окрасить обычными способами или обнаружить методом авторадиографии, если антиген или антитела несут радиоактивную метку. Отметим, что преципитация здесь требует подбора концентраций и довольно значительного времени диффузии антигенов в агарозу для обеспечения эквивалентного соотношения концентраций антител и антигена.
Радиоактивность в места преципитации иммунного комплекса можно ввести и с помощью меченого белка. А, как будет показано ниже. Воспользовавшись сделанной ранее отметкой для совмещения реплики и оригинала, нетрудно определить положение полосы искомого антигена среди прочих белков на электро-фореграмме. Если эту полосу в геле желательно окрасить, то поверхность ПААГ следует предварительно протереть 1 % -ным раствором ДДС-Na, для того чтобы удалить с нее адсорбированные белки сыворотки [Showe et al., 1976].
Реплика на диазобумаге
Вместо пленки агарозы белки из ПААГ или агарозного геля можно переводить на ДБМ-бумагу, введенную в практику биохимических исследований Олвином. Диазобумагу готовят, обрабатывая обычную фильтровальную бумагу .и-нитробензилокси-метил пиридином при повышенной температуре. В результате этого нитробензильная группа присоединяется к бумаге. Затем нитрогруппу восстанавливают до аминогруппы обработкой гидросернистокислым натрием (Na2 S2 Ot). Так получают амино-бензилоксиметилбумагу («АБМ-бумагу»). Ее сейчас выпускает в готовом виде фирма «Collaborative Research» (США) под названием «Ultra Blot». Непосредственно перед использованием аминогруппу заменяют диазогруппой путем обработки нитритом натрия и соляной кислотой. Полученный материал носит назва-
ние «диазобумаги», или «ДБМ-бумаги» (диазобензилоксиме-тилбумаги). Подробное описание всей последовательности операций можно найти в оригинальной работе [Alwine et al., 1977]. По активным диазогруппам к бумаге ковалентно присоединяются белки.
