Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 59

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 53 54 55 56 57 58 < 59 > 60 61 62 63 64 65 .. 140 >> Следующая

кая чувствительность кольцевого теста более чем достаточна для контроля за ходом иммунизации, а простота и быстрота этого теста дают ему явные преимущества.
С этой точки зрения вряд ли имеет смысл использовать для контроля за развитием иммунного ответа и описанные ниже методы, основанные на диффузии и преципитации иммунных комплексов в гелях агарозы или агара, хотя это и встречается нередко в научной литературе. Чувствительность диффузионных методов того же порядка, что и для преципитации в жидкости. Возможность окрашивания преципитатов в геле дает относительно небольшой выигрыш в чувствительности, поскольку лимитирующим фактором является образование пространственной сетки преципитата. Вместе с тем, все диффузионные методы требуют много времени.
Иное дело, когда эти методы используются для определения гомогенности антисыворотки или моновалентности ее антител. Здесь методы диффузии и преципитации в геле имеют определенные преимущества ввиду возможности образования, фиксации и окраски нескольких независимых зон (полос) преципитации для разных пар антиген — антитело, обнаруживающих себя при сочетании обследуемой антисыворотки с растворами разных антигенов.
Метод Ухтерлони
Наиболее широко распространен метод двойной радиальной диффузии в геле, предложенный Ухтерлони [Ouchterlony, 1950].
1%-ным горячим раствором агарозы или 1,5%-ным раствором агара в 0,05—0,075 М Трис-барбитуратном (Трис-боратном или Трис-HCl) буфере (pH 8,0—8,6) с 0,1—0,15 М NaCl заливают обезжиренные, строго горизонтально расположенные стекла так, чтобы получить слой толщиной примерно 1,5 мм. В тех случаях, когда для растворения антигена использовали додецил-сульфат натрия (ДДС-Na), в раствор агарозы добавляют до 1% неионного детергента Тритона Х-100. Дело в том, что ДДС-Na даже в концентрации 0,05% заметно ингибирует образование иммунного комплекса антиген — антитело. Тритон Х-100 связывает ДДС-Na в смешанные мицеллы и тем самым снимает ингибирование. Впрочем, даже если и нет ДДС-Na, то 0,5—1% Тритона Х-100 или дезоксихолата натрия (ДОХ-Na) нередко добавляют в среду, где идет иммунная реакция, с тем чтобы уменьшить неспецифическую сорбцию белков на пространственной сетке преципитата. Образованию самих иммунных комплексов эти детергенты не мешают. В тех случаях, когда содержание ДДС-Na в растворе антигена очень велико, можно от него избавиться предварительно, например продолжительным центрифугированием исходного препарата на большой скорости в линейном градиенте плотности раствора сахарозы с добавлением 0,1—1% Тритона Х-100. ДДС-Na снимается с белка, а образуемые им с Тритоном комплексные мицеллы всплывают к менис-
ку центрифужной пробирки [Bhakdi, 1980]. Кстати, в цитируемой работе было показано, что антигенные свойства большинства белков не страдают от временного комплекса с ДДС-Na.
В затвердевшем геле по шаблону вырезают центральное отверстие— «лунку», а вокруг него еще 4 или б лунок, так чго расстояние между ними составляет 5—10 мм. Лунки вырезают трубочками с острыми краями диаметром 3—4 мм, а гель из них удаляют. Лунки заполняют до краев соответствующими растворами. Например, в центральную лунку наливают более или менее разбавленную антисыворотку, а в периферические — серию разбавлений исходного раствора антигена (рис. 29). Сыворотку и антиген разбавляют физиологическим раствором или тем же буфером. Это делается для подбора оптимального соотношения их концентраций (см. ниже). Затем пластинку помещают во влажную камеру. И ммунодиффузию ведут иногда на холоду, а иногда при комнатной температуре или в термостате при 37°. Она продолжается не менее суток, а порою и несколько дней. Полосы преципитата можно наблюдать и фотографировать во влажном геле на темном фоне при освещении пластинки снизу и сбоку. Они рассеивают свет и в прозрачном геле видны хорошо. Перед окрашиванием неосажденные белки вымывают в течение суток в двух — трех сменах 0,15 М раствора NaCl. Полосы преципитата можно окрашивать точно так же, как было описано ранее для электрофореза и ИЭФ белков [Huchzermeier et. al., 1980].
Рассмотрим теперь сам процесс образования полос преципитации. Молекулы антител и антигена диффундируют из своих лунок радиально во всех направлениях. Их концентрации в геле убывают по мере удаления от лунок, но в любой точке они пропорциональны соответствующим исходным концентрациям. В какой-то точке, находящейся на прямой, соединяющей центры лунок антисыворртки и антигена, диффундирующие навстречу друг другу потоки антигенов и антител впервые встречаются. Вначале это не препятствует дальнейшей диффузии. Однако по мере возрастания концентраций в области перекрывания встречных потоков там образуется зона оптимального соотношения концентраций антител и антигена и начинается формирование преципитата. Это ограничивает дальнейшую диффузию в радиальном направлении, так как новые порции антител и антигена будут достигать этой зоны в том же самом оптимальном соотношении и тоже будут выпадать в осадок. Между противолежащими лунками образуется полоса преципитата, постепенно удлиняющаяся симметрично в обе стороны.
Предыдущая << 1 .. 53 54 55 56 57 58 < 59 > 60 61 62 63 64 65 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed