Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
нами. Для окраски бумажной реплики можно использовать специфические красители, позволяющие выявить определенные белки. С той же целью используют ферментативные, иммунохи-мические и иные специальные реакции, а также авторадиографию или флюорографию— для радиоактивно меченных белков.
Ввиду того, что фиксация белков в геле сефадекса не производится, во избежание диффузии белков немедленно после снятия реплики в гель погружают «фракционирующую сетку». Последняя представляет собой рамку немного меньшего размера, чем гель, в которой параллельно ее коротким сторонам и перпендикулярно плоскости рамки на равных расстояниях друг от друга закреплены 30 тонких, выступающих вниз металлических пластинок. При вдавливании в слой сефадекса до самого его дна пластинки рамки разделяют гель в направлении фракционирования белков на 30 изолированных секций. В каждой из них с помощью торцевого электрода можно измерить pH и по 30 точкам построить график истинного градиента pH вдоль геля. Путем сопоставления с окрашенными полосами на реплике легко установить, в какие секции попали сфокусированные белковые зоны. Из этих секций сефадекс вместе с белками извлекают с помощью шпателя (рис. 17). Аналогичная по своему назначению рамка фирмы «Pharmacia» снабжена прорезями, в которые разделительные пластинки можно устанавливать по выбору экспериментатора в соответствии с расположением и шириной белковых зон, обнаруженных на окрашенной реплике.
Перед извлечением сефадекса подготавливают достаточное число колонок объемом 5—10 мл. Можно, например, воспользоваться цилиндрами шприцов, заткнув их наконечники стеклянной ватой. Сефадекс из каждой отобранной секции шпателем переносят в отдельную колонку, суспендируют в буфере, дают осесть гелю, а затем элюируют белки примерно двумя объемами буфера по отношению к объему осевшего сефадекса. Поскольку белки не входят внутрь гранул сефадекса, элюция получается практически полной.
Белки от амфолитов в элюате можно отделить диализом, осаждением сульфатом аммония или гель-фильтрацией на се-фадексе G-50. При этом в раствор рекомендуется ввести до
0,5 М NaCl для уменьшения электростатических взаимодействий между белками и амфолитами. Полное освобождение от амфолитов путем обычного диализа требует длительного времени (около 32 ч). Его можно значительно сократить, если есть возможность воспользоваться диализом в «биофибрах» или ультрадиализом под давлением в ячейках типа «Amicon». Если очищенные белки выдерживают осаждение сульфатом аммония, то этот способ очистки следует предпочесть как более быстрый. Амфолиты не выпадают в осадок даже из насыщенного раствора сульфата аммония. Для полного удаления амфолитов осадок белка следует трижды промыть таким же раствором сульфата аммония и лишь после этого растворять в буфере. Гель-фильтра-
ция, как обычно, занимает немного времени, но требует определенной подготовки.
Кроме очевидного удобства внесения препарата (в любой точке градиента pH), обнаружения и элюции белков, что обусловлено горизонтальным расположением и открытой поверхностью геля, подчеркнем относительную нечувствительность рассматриваемого метода к возможности выпадения в осадок некоторых белков вблизи их изоэлектрической точки. В описанной системе эти осадки будут уходить на дно слоя геля, освобождая его сечение для свободного протекания тока и миграции других белков. При извлечении сефадекса из секции осадок можно собрать вместе с гелем, перенести в колонку и в ходе элюции снова растворить, использовав для этого подходящий буфер или солевой раствор. Возможность примириться с выпадением осадков особенно ценна на ранних стадиях очистки, когда очищаемый белок может составлять лишь малую долю всей белковой смеси. Допуская выпадение в осадок балластных белков, можно значительно увеличить загрузку геля и повысить выход нужного белка. Практика показывает, что для узких диапазонов pH загрузку гранулированного геля при ИЭФ можно довести в случае одного основного белка до 2—4 мг на 1 мл объема геля, а для смеси белков —до 5—10 мг/мл. При объеме геля в 80 мл это составляет внушительную величину общей загрузки — до 800 мг белковой смеси.
Препаративное ИЭФ в гранулированном геле сефадекса получило в последние годы широкое распространение для очистки самых разнообразных белков. В качестве примеров назовем изящную работу Бойда и Спелсберг, где белки-рецепторы прогестерона яйцевода очищали методом ИЭФ в виде комплекса с радиоактивно меченным прогестероном [Boyd, Spelsberg, 1979], и уже упомянутую работу Леграверенда и Глазер, в которой при очистке негистонового белка хроматина печени крысы во избежание его агрегации и окисления ИЭФ проводили в присутствии 5 М мочевины и 1 мМ р-меркаптоэтанола.
ИЭФ белков с препаративными целями можно осуществить и в агарозе. На пластинке 0,8%-ного геля агарозы толщиной 2,5 мм в приборе «Мультифор» удавалось фракционировать методом ИЭФ до 1 г белков плазмы [Chapuis-Cellier, Arnaud, 1981]. Для нанесения такого количества белка на гель диализованный препарат плазмы концентрировали ультрафильтрацией до содержания белка 200 мг/мл. 5 мл такого концентрата смешивали при 30° с легкоплавкой агарозой, заливали в виде пластинки толщиной 2 мм и накладывали ее с одного конца на предфокусированный рабочий гель агарозы. Электрофокусирование при мощности 15 Вт занимало 8 ч. Авторы утверждают, что воспроизводимость картины ИЭФ в агарозе заметно лучше, чем на сефадексе. Однако извлечь белки из агарозы значительно сложнее, чем из слоя сефадекса.
