Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИЭФ ВО ВТОРОМ НАПРАВЛЕНИИ
В этом случае общий подход остается тем же, что и раньше: в одном направлении белки фракционируют по размерам методом электрофореза в присутствии ДДС-Na, а в другом — по значениям р! методом ИЭФ, но последовательность применения этих двух методов меняется, Уже упоминалось, что ДДС-Na, используемый для растворения белков, можно вытеснить из комплекса с ними избытком неионного детергента NP-40, однако речь шла о сравнительно небольших добавках ДДС-Na. Можно ли добиться достаточно полного для целей последующего ИЭФ удаления ДДС-Na с белка, прошедшего жесткую обработку высокой концентрацией ДДС-Na и fj-маркаптоэтанола при 100°, как это предусмотрено в соответствующих методах электрофореза? Оказывается, можно.
Данно показал, что при проведении ИЭФ в геле, содержащем 8 М мочевину, ДДС-Na постепенно снимается с белка и под действием электрического поля быстро уходит к аноду [Danno, 1977]. Освободившийся белок может нормально фокусироваться в соответствии с характерным для него значением pi. Он проводил разделение окрашенных флюоресцамином белком в цилиндрическом геле первого направления по классической схеме электрофореза в присутствии ДДС-Na [Остерман, 1981], затем вырезал окрашенные белковые зоны и встряхивал их в течение 15 мин при комнатной температуре в 8 М растворе мочевины с 2% амфолинов диапазона pH 3,5—10 (для зон толщиной менее
2 мм эту операцию можно опустить). Во втором направлении Данно проводил ИЭФ в трубке размером 10X0,5 см с 5%-ным ПААГ, полимеризованным в 8 М растворе мочевины, содержащем 2% амфолинов для диапазона pH 3,5—10. На торец геля в трубке он клал кусочек геля, содержащий белковую зону первого направления, заливал его тем же раствором, но с добавлением 5% сахарозы, а затем наслаивал анолит, в качестве которого использовал 1,7% -ный раствор Н»Р04. Анод, естественно, располагался над препаратом. После включения напряжения ДДС-Na постепенно снимался и уходил вверх к аноду, а осво-
РП
бодившиеся от него белки вступали в гель трубки, мигрировали вдоль градиента pH в сторону катода и фокусировались.
Годом позже аналогичный подход был использован для сопоставления генетических вариантов одного и того же белка [Singer et al., 1978]. Авторов интересовали мутационные замены одной аминокислоты, что могло приводить к изменению изоэлек-трической точки белка при сохранении его молекулярной массы, поэтому в первом направлении для отбора из разных препаратов нужного белка использовали электрофорез в пластине ПААГ, содержащего ДДС-Na. Его вели под контролем данзили-рованного препарата, мигрирующего в отдельном треке. На уровне полосы обследуемого белка в этом треке вырезали горизонтально расположенную полоску геля поперек всей пластины первого направления. Ее и использовали далее в качестве исходного препарата для ИЭФ в пластине второго направления. В этой пластине полимеризовали 4%-ный ПААГ, содержавший, как обычно, 6 М мочевину, 2% NP-40 и 2% амфолинов. Ее устанавливали горизонтально в прибор «Мультифор» и на открытую поверхность со стороны анода накладывали полоску, вырезанную из геля первого направления, без какой-либо ее предварительной промывки. Для улучшения контакта и во избежание сдвига самой полоски к аноду (ведь она импрегнирована ДДС-Na) ее прижимали полоской стекла. Затем накладывали электроды, включали напряжение и приступали к фокусированию, как описано выше. Полоска геля первого направления здесь играла ту же роль, что и кусочки фильтровальной бумаги, смоченные раствором препаратов, при горизонтальном ИЭФ. До 90% белкового материала переходило в гель второго направления и фокусировалось в нем, а ДДС-Na отделялся и уходил к аноду. По положению сфокусированных полос белка на градиенте pH судили об изменениях pi в результате мутаций.
Такую же последовательность разделений использовали для двумерного фракционирования сложной смеси белков фибро-бластов почки хомячка [Tuszynski et al., 1979]. Белки экстрагировали в присутствии 2% ДДС-Na и фракционировали в первом направлении на пластине толщиной 1,5 мм классическим методом Лэммли с использованием градиента концентрации ПААГ (7—13%)- Исходный материал для ИЭФ на втором этапе разделения на этот раз поставляла полоска геля, вырезанная продольно вдоль поля, т. е. один из треков пластины первого направления. Фокусирование, как и в предыдущем случае, проводили в приборе «Мультифор» на горизонтальной пластине 4,5%-ного ПААГ в присутствии 8,5 М мочевины и 2,5% NP-40, но в более узком диапазоне pH (5—7). По-видимому, для более быстрого фракционирования кислых белков авторы накладывали полоску геля первого направления на пластину со стороны катода. Кроме того, равномерность перехода белков из полоски в пластину могла пострадать от того, что концентрация ПААГ менялась от 7 до 13% вдоль полоски. Из-за этих двух обстоя-
тельств авторы ввели этап промежуточного электрофореза, в ходе которого белки отделялись от ДДС-Na и переходили в 4,5%-ный ПААГ. Полоску трека первого направления зажимали в форму и полимеризовали над ней небольшой слой 4,5%-но-го ПААГ с буфером формирующего геля системы Лэммли. Анод помещали внизу, под слоем; в качестве катодного буфера использовали Трис-глициновую смесь системы Лэммли. Над полоской геля первого направления наносили смесь двух краси* телей — бромфенолового синего и пиронина. При включении напряжения ДДС-Na снимался с белков и уходил вместе с розовым фронтом пиронина к аноду* Белки из градиентного геля переходили в 4,5%-ный ПААГ в непосредственном соседстве с полосой бромфенолового синего. Ориентируясь по ней, из геля вырезали новую полоску и уже ее использовали в качестве исходного препарата для ИЭФ.
