Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
ИЭФ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ
РАСТВОРА САХАРОЗЫ
Этот метод был отработан и внедрен в исследовательскую практику первым. Колонки для ИЭФ в градиенте плотности сахарозы были выпущены в продажу фирмой «LKB» еще десятилетие тому назад. Они нашли широкое применение и до сих пор выпускаются в неизменном виде, хотя создается впечатление, что препаративное ИЭФ в гранулированном геле благодаря рассмотренным выше преимуществам вытесняет ИЭФ в градиенте плотности сахарозы.
Тем не менее, ввиду широкой распространенности метода ИЭФ в жидкостных колонках следует рассмотреть его особенности. Процесс ИЭФ белков здесь протекает в растворе амфо-литов без носителя. Опасность конвекционного перемешивания слоев жидкости блокируется созданием по высоте колонки достаточно крутого линейного градиента плотности раствора сахарозы, которая не мешает формированию градиента pH и фокусированию белков. Колонку заполняют с помощью перистальтического насоса из смесителя градиента того же типа, что используется для приготовления линейных градиентов плотности растворов сахарозы для ультрацентрифугирования [Остерман, 1981]. На дно колонки амфолиты поступают в 50%-ном растворе сахарозы, к ее верхнему концу концентрация сахарозы снижается до 5%.
Конструкция колонки
На рис. 18 показана схема колонки фирмы «LKB», изготовленной из стекла. Раствор амфолитов и сахарозы заполняет кольцевую камеру между наружной охлаждающей рубашкой и внутренним цилиндром, где тоже циркулирует охлаждающая вода. По оси внутреннего цилиндра от воды отделена еще одна центральная полость, через которую проходит стержень, несущий на себе платиновую проволочку нижнего электрода. Во время фокусирования эта полость заполнена раствором электролита. После окончания ИЭФ при опорожнении колонки через расположенное 'внизу отверстие электролит запирают в центральной полости. Для этой цели служит клапан, который в соответствующий момент времени можно поднять с помощью того же центрального стержня. Второй электрод в виде платинового кольца находится в верхней части рабочей камеры. Клеммы обоих электродов выведены на пластмассовую головку колонки. Заполнять колонку можно как через центральную полость, так и подавая жидкость непосредственно в кольцевую рабочую камеру. Для этого в верхней части колонки предусмотрены соответствующие трубки. Фирма «LKB» выпускает два типа колонок описанной конструкции с рабочими объемами 1 50 и 440 мл.
Заполнение колонки производят в два этапа. Сначала при открытом клапане через центральную трубку на дно колонки подают нижний электролит, в котором растворена сахароза до концентрации 60%. Объем электролита таков, что его уровень оказывается на этом этапе заметно выше нижнего края трубки. Затем из смесителя градиента непосредственно рабочую намеку заполняют раствором амфолитов в указанном градиенте концентрации сахарозы. При этом нижний электролит частично вытесняется обратно в центральную трубку, но так, что при целиком заполненной рабочей камере конец трубки все еще остается погруженным в электролит. Наконец, в область расположения верхнего электрода наслаивают верхний электролит, не содержащий сахарозы. В качестве электролитов используют 0,25 М NaOH и 0,15 М НаР04.
Внесение препарата
Есть три возможности внесения раствора белкового препарата в колонку.
1. Проще всего смешать препарат с одной или обеими жидкостями в смесителе градиента, соответственно добавив в них амфолитов и сахарозы. Этот метод особенно удобен, если объем препарата велик, например на первых стадиях очистки белка.
2. Препарат можно внести в виде узкого слоя в любое место по высоте колонки, например туда, где ожидается фокусирование зоны очищаемого белка. Для того чтобы при этом не слишком сильно нарушался градиент плотности, поступают следующим образом. Колонку заполняют, как обычно, из смесителя градиента, но только до намеченного уровня. Затем жидкость из смесителя подают в три пробирки, внося в них последовательно 0,5, 3 и 0,5 мл. В среднюю
бавляют 0,5— мл белкового раствора, затем постепенно добавляют концентрированный раствор сахарозы до тех пор, пока плотность смеси в пробирке снова станет промежуточной между плотностями растворов в первой и третьей пробирках — капля этой смеси при осторожном внесении должна опускаться на дно в третьей пробирке и оставаться на поверхности жидкости в первой пробирке. После
Рис. 18. Схема устройства колонки фирмы «LKB» для препаративного ИЭФ в жидкой среде с градиентом плотности сахарозы
этого содержимое второй пробирки наслаивают на поверхность уже внесенной чаети градиента в колонке и продолжают ее заполнение из смесителя градиента. Вносить жидкость в колонку следует очень осторожно, через гибкую трубочку, прилегающую своим концом к стенке камеры, со скоростью 1 или 4 мл/мин в зависимости от типа колонки.
3. Слой препарата можно внести в выбранную точку градиента pH после его установления в колонке под действием электрического поля. Для этого выключают напряжение и осторожно опускают тонкую трубочку до намеченного уровня. С помощью перистальтического насоса через нее отсасывают 4 мл жидкости из уже сформированного градиента и помещают их в три пробирки, как описано выше. Затем производят аналогичную операцию внесения препарата в среднюю пробирку и подбора плотности смеси. Не меняя положения трубочки в колонке, накачивают ранее извлеченный слой градиента с внесенным в него препаратом на прежнее место.
