Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Получение амфолитов для узких диапазонов pH
Теперь уместно напомнить еще об одном применении колонок с градиентом плотности раствора сахарозы, где они оказываются вне конкуренции. Это — получение амфолитов для более узких диапазонов pH, чем те, на которые рассчитаны продажные препараты. Эта операция была описана в гл. 1. Отметим, что в данном случае следует не только увеличить исходную концентрацию амфолитов, но и уменьшить концентрацию сахарозы, например создать градиент ее концентрации 0—10%. При фракционировании амфолитов такой градиент будет оказывать достаточное противодействие конвекции жидкости, к тому же отпадает -необходимость последующего отделения амфолитов от сахарозы, что сделать достаточно трудно. Отбор амфолитов, лежащих в очень узком диапазоне pH, для разделения белков с близкими значениями pi, можно производить вместе с самими белками. ИЭФ в этом случае проводят в два этапа. На пер-
йом, использующем амфолиты нормального диапазона pH, отделяются посторонние белки. Подлежащие дальнейшему фракционированию близко лежащие компоненты белковой смеси отбирают вместе с частью амфолитов, которые могут обеспечить узкий диапазон pH, например в 0,5 ед. При повторном ИЭФ в градиенте pH такого диапазона, растянутом на всю высоту колонки или длину геля, близкие по pi белки могут образовать отдельные зоны.
Колонки фирмы «ISCO»
В заключение упомянем о своеобразной конструкции колонок для ИЭФ в градиенте плотности раствора сахарозы, разработанной фирмой «ISCO* (модель 212). Конструкторы этой фирмы стремились предоставить экспериментатору возможность следить за миграцией белков в ходе их фокусирования путем периодического сканирования всего градиента при 280 нм. На самой рабочей колонке это сделать не удается ввиду необходимости заключить ее в охлаждающую рубашку. Было найдено оригинальное, хотя и довольно сложное решение проблемы. Накачивая снизу в колонку плотный раствор сахарозы, ее содержимое, т. е. весь градиент pH, периодически поднимают в присоединенную сверху к колонке кварцевую трубку того же диаметра. При этом весь градиент последовательно проходит мимо облегающего эту трубку узла УФ-денситометра, для которого небольшой участок трубки играет роль цилиндрической кюветы. Затем весь столб жидкости возвращается обратно в колонку. Электрическое напряжение на рабочую колонку подается через расположенные по ее концам цилиндрические мембраны. На 'время сканирования напряжение выключается. Содержимое колонки элюируют в коллектор фракций также путем выдавливания градиента вверх. Объем колонки (охлаждаемой только снаружи)—23 мл, а максимальная загрузка может составлять 10 мг белка. Все эти дорогостоящие усложнения не кажутся достаточно оправданными; судя по публикациям последних лет, колонки «ISCO» широкого распространения не получили.
В интересах экономии места и из-за наметившегося вытеснения колонок для препаративного ИЭФ гранулированными гелями не будем рассматривать примеры применения ИЭФ в градиентах плотности растворов сахарозы. Читатель найдет их во множестве в периодической литературе 70-х годов, а исчерпывающую библиографию по этому поводу — в ежегодном справочном издании фирмы «LKB» «Acta ampholinae».
Глава 5 ИЗОТАХОФОРЕЗ
Этот относительно новый метод фракционирования биологических молекул, в том числе и белков, предложен специалистами фирмы «LKB» более 10 лет назад. С тех пор фирма не прекращает усилий по пропаганде метода и рекламе разработанного специально для него прибора «Тахофор». Однако широкого распространения для фракционирования и исследования белков метод пока не получил. На то есть объективные причины; некоторые из них будут названы ниже. В связи с этим мы ограничимся кратким знакомством с принципом и особенности-ми метода изотахофореза в ожидании его дальнейшего развития.
Этот принцип проще всего понять, отталкиваясь от проведенного в предыдущей книге подробного рассмотрения процессов ступенчатого электрофореза [Остерман, 1981]. Вспомним поведение используемых там двух сильно отличающихся по электрофоретической подвижности анионов — хлора и глицина. Хлор в ходе электрофореза отходит к аноду, и вслед за ним из катодного резервуара движется отрицательно заряженный при щелочном pH ион глицина. Значение pH задается Трис-буфе-ром. В любой ситуации, при любом pH ион глицина следует вплотную за ионом хлора. В формирующем геле при pH 6,8, когда электрофоретическая подвижность глицина мала, происходит перераспределение напряженности электрического поля таким образом, чтобы обеспечить миграцию ионов глицина с такой же скоростью, как и ионов хлора. Разрыва между ними быть не может — иначе бы не было тока. Перераспределение напряженности поля вдоль столбика геля при ступенчатом электрофорезе используется для сужения исходной полосы смеси белков. Существенно, что концентрация белков при этом настолько мала, что вклад их собственной ионной проводимости незначителен по сравнению с электропроводностью буфера. Белки мигрируют в электрическом поле, не зависящем от их присутствия. Ион глицина обгоняет самый быстрый из белков, и собственно фракционирование белковой смеси происходит в Трис-глициновом буфере с pH 8,8 — в поле неизменной напряженности.
