Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Если ставится задача разделения только щелочных белков, то ПААГ можно полимеризовать с амфолинами диапазона pH 7—10. Правда, с ними гель полимеризуется труднее, чем с нейтральной смесью амфолинов, поэтому концентрацию персульфата аммония и ТЕМЭД в геле следует удвоить (0,02% и 0,14% соответственно). Присутствие в исходном белковом препарате ДДС-Na мешает фракционированию — связанный с белками ДДС-Na тормозит их миграцию к катоду. Если ДДС-Na необходим для первоначального растворения белков, то перед фракционированием его следует вытеснить из комплексов с белками избытком NP-40. Последний в этом случае вносят не только в раствор препарата (до 2%), но и в раствор мочевины и амфолинов, который наслаивают на препарат (до 5%).
Картина разделения сложной смеси кислых и щелочных белков в первом направлении при использовании амфолинов диапазона pH 3,5—10 получается не очень хорошей. Кислые белки, как было отмечено, успевают сфокусироваться, но это происходит на коротком отрезке кислого участка градиента pH. Щелочные же белки начинают заметно различаться по своей электрофоретической подвижности и соответственно фракционироваться только во второй половине своего пути через гель. Такого рода фракционирование полезно для первоначального обзора всего набора белков. Далее исходную смесь следует в одном эксперименте разделить методом ИЭФ, как описано О’Фарреллом, а в другом — подвергнуть электрофорезу в формирующемся градиенте pH с амфолинами для диапазона pH 7—10 или смесью амфолинов для диапазонов pH 6—8 и 8—10 (по 1% каждого).
В первом случае щелочные белки смеси окажутся вне геля, » во втором — кислые белки будут оттеснены к самому его концу.
Сандерс и соавторы использовали описанный метод для фракционирования гистонов из культивируемых клеток глиомы [Sanders et al., 1980]. Естественно, что гистоны должны быть надежно отделены от ДНК, иначе остатки ДНК в комплексе с гистонами независимо от pH будут сообщать этому комплексу отрицательный заряд, поэтому он не сможет даже войти в гель. Авторы растворяли клетки в 10 М растворе мочевины с добавлением 0,2% ДДС-Na и 0,03 М лизина при pH 4,8. Затем в раствор добавляли 0,4 М NaCl и этим ослабляли комплекс гистонов с ДНК. Однонитевые участки ДНК переваривали нук-леазой S1, затем следовало дробление ультразвуком и уже перед самым нанесением на гель — окончательная диссоциация комплексов и осаждение ДНК протаминсульфатом в концентрации 0,4 мг/мл (трехкратный избыток по отношению к массе гистонов).
Для электрофореза гистонов в формирующемся градиенте pH первого направления авторы отдают предпочтение амфоли-нам диапазона pH 6—8. Хорошо заряженные гистоны мигрируют быстро, и все фракционирование заканчивается за 2 ч. На 20 мкл исходного препарата в трубке диаметром 2,4 мм из-за наличия в нем 0,2% ДДС-Na наслаивали 10 мкл 8 М раствора мочевины, содержащего 5% NP-40, 0,8% амфолинов pH 5—7 и 0,2% амфолинов pH 3,5—10. На пластине второго направления одновременно с гистонами было выявлено около 130 белков основного характера.
Аналогичным способом недавно были разделены белки хроматина зародыша морского ежа [Kuhn, Wilt, 1980]. Радиоактивную метку в белки вводили in vitro при обработке формальдегидом и [sH]NaBH4 (см. часть III). Меченый хроматин также растворяли в 10 М растворе мочевины с 0,03 М лизина, но без ДДС-Na, переваривали нуклеазой S1, а затем в раствор вносили 4% NP-40, 5% p-меркаптоэтанола и 4% биолитов диапазона pH 3—10. По-видимому, этого было достаточно для диссоциации гистонов от ДНК. Для электрофореза в формирующемся градиенте pH концентрацию биолитов того же диапазона увеличивали до 4,8% и выравнивали электропроводность вдоль градиента добавлением аргинина, лизина и аспарагиновой кислоты (по 0,8 мг/мл). Режим электрофореза в трубках размером 150х Х2,5 мм включал четыре 5-минутных интервала с повышением напряжения на 100 В в каждом и основное фракционирование в течение 3 ч при 520 В. В работе содержится важное практическое замечание о том, что катодный конец трубки не следует погружать в 0,02 М NaOH глубже, чем на 2 мм. В противном случае щелочь заметно проникает в гель и «сжимает» катодный конец градиента pH, куда и приходят гистоны. Иногда даже с этого конца геля авторы использовали фитили из смоченной щелочью фильтровальной бумаги.
Электрофорез во втором направлении проводили по методу Лэммли, в пластине размером 20X16X0,15 см, используя вогнутый экспоненциальный градиент ПААГ (10—30%) . Для того чтобы осуществить непосредственный контакт цилиндрика геля первого направления с торцом геля второго направления, при заливке последнего стеклянную форму наращивали резиновым кольцом и смесь мономеров заливали до уровня на 5 мм выше верхних краев стеклянных пластинок формы. После полнмери* зации кольцо снимали и гель обрезали вровень с краями стекол. Цилиндрик геля в этом случае можно не заливать агарозой, а просто прижать к торцу пластины, уложив на него стеклянную палочку, которую через 30 мин после начала электрофореза можно снять. Электрофорез начинали при силе тока 30 мА, а далее вели в течение 18 ч при 11 мА. Белки фиксировали в геле 10%-ным раствором СН3СООН в 40%-ном этаноле; радиоактивные пятна регистрировали флюорографически.
