Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Однако Уиллард и соавторы утверждают, что полного растворения основных белков (из гепатомы Новикова) не удается добиться с помощью мочевины, NP-40, умеренных концентраций ДДС-Na, а также с помощью цетавлона и ряда других детергентов катионной природы. Решить проблему растворения и фракционирования основных белков в системе формирующегося градиента pH удалось путем использования в качестве детергента 0,5%-ного раствора дипальмитоил-Ь-а-фосфатиднлхолина в сочетании с 9,5 М мочевиной [Willard et al., 1979].
РАСШИФРОВКА КАРТИН ДВУМЕРНОГО ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКОВ ПО МЕТОДУ О’ФАРРЕЛЛА
Как уже упоминалось, в результате такого фракционирования получается сложная картина, насчитывающая иной раз более тысячи пятен. Она проявляется обычными методами — окрашиванием красителем СВВ R-250 или (в случае радиоактивных белков) авторадио- и флюорографией. После этого возникает нелегкая задача идентификации каждого пятна и сопоставления расположения пятен в различных опытах с учетом неизбежных отличий, вытекающих из невозможности абсолютна точного воспроизведения условий разделения, особенно при электрофорезе в формирующемся градиенте pH. Для решения этой задачи необходимо ввести какие-то системы отсчета, более надежные, чем простое измерение координат пятен.
Прежде чем описать такие системы, упомянем еще об одном способе регистрации самих пятен — с помощью флюоресцентного красителя флюоресцамина. Такой способ был предложен недавно [Jackowski, Liew, 1980]. Пластину второго направления фиксировали в течение ночи в растворе, содержащем 10% СНзСООН и 50% метанола, одновременно вымывая из нее амфолины, затем споласкивали 7%-ной СН3СООН и помещали на
1 ч в диметилсульфоксид (ДМСО). После этого пластину переносили в 0,04 М. раствор борной кислоты в ДМСО, титрованный до pH 10 добавлением 0,01 М NaOH, Щелочная среда благоприятствует реакции присоединения флгооресцамина по аминогруппам белков [Остерман, 1981]. Через 2 ч добавляли равный объем раствора флюоресцамина в ДМСО (0,5 мг/мл) и встряхивали в течение 8 ч. Пятна белков становятся заметными уже через 2 ч. Их фотографируют, освещая пластину геля относительно длинноволновым УФ-светом.
Теперь обратимся к способам идентификации пятен, для чего в столь сложных случаях естественно было бы опираться на какую-то надежную систему белков-маркеров. Такая система была недавно предложена [Anderson, Hickman, 1979]. Авторы брали какой-либо хорошо изученный белок (например, гемоглобин или креатинфосфокиназу), растворяли его до концентрации 5 мг/мл в 8 М мочевине и выдерживали л л и квоты этого раствора при 95° в течение 2, 4, 8, 10, 15, 30, 45, 60 и 90 мин. В зависимости от продолжительности такой инкубации происходило все более значительное разложение мочевины и все более полное карба-моилирование белка. Присоединение каждого остатка карба-миновой кислоты по аминогруппе лизина или аргинина уменьшает число положительно заряженных групп в белке на единицу, и соответственно изменяется изоэлектрическая точка белка. Смесь обработанных таким образом аликвот маркерного белка при внесении ее одновременно с препаратом в двумерную систему фракционирования по О’Фарреллу дает в геле второго направления цепочку пятен, лежащих на одном горизонтальном уровне (очень малое приращение молекулярной массы маркера за счет карбамоилирования практически не заметно). Эта цепочка перекрывает широкий диапазон изменения pi. Используя в разных опытах одну и ту же маркировочную смесь, можно сравнивать между собой расположения пятен исследуемых белков, сопоставляя их по положению с близлежащими пятнами цепочки. Собственно говоря маркировка, или «привязка», здесь производится только по значениям pi.
В другой недавней работе была предложена система маркерных белков и для разделения во втором направлении — по размерам. В качестве такой системы авторы (в их числе и Н. Андерсон) рекомендуют использовать всю, очень стабильную совокупность белков сердца крысы. Подробно описана воспроизводимая процедура получения соответствующего гомогената. Его подмешивают к агарозе, которой заливают цилиндрик геля первого направления при фиксации его по торцу пластины второго направления. Равномерно распределенные по всей длине цилиндрика, белки сердца после электрофореза во втором направлении образуют на пластине ряд параллельных полос. 80 характерных полос этого набора пронумерованы от нижнего до верхнего края пластины. Они перекрывают широкий диапазон молекулярных масс, так что с ними можно соотносить положе-
ния пятен после фракционирования сложных смесей исследуемых белков. Для 12 наиболее интенсивных полос набора определены молекулярные массы, лежащие в интервале 15—220 тыс. дальтон [Giometti et al., 1980].
Недавно сообщалось, что в Аргоннской национальной лаборатории (США) Н. Г. и Н. Л. Андерсон, автоматизировав метод О’Фаррелла так, что в день фракционируется более 100 препаратов, начали картирование всех белков и белковых субъеди-ниц человека, число которых достигает 50 тысяч. Значение такого рода атласа для целей диагностики и лечения многих заболеваний, в частности злокачественных трансформаций тканей, трудно переоценить [Bishop, 1979Ь].
