Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Оптимальную степень высыхания суспензии другой концентрации можно определить опытным путем. Для этого следует провести предварительно подсушивание замоченного в воде сефадекса до появления первых видимых трещин на его поверхности, путем взвешивания определить потерю воды, отвечающую этому моменту, и при подготовке рабочего геля сушить его до
тех пор, пока потеря воды не составит 75% от определенного таким образом количества.
Фирма «Bio-Rad» для своих гелей рекомендует более простой способ сушки. По концам подноса на гель накладывают фитили из нескольких слоев фильтровальной бумаги и сменяют их до тех пор, пока
Рис, 15, Влияние ионогенных приме-
сей в сефадексе на картину препаративного фракционирования белков
А — промытый сефадекс; Б — продажный препарат без промывки
поверхность геля не иудет казаться сулил, чти^ма %гпт шик-ia^ советует замочить 15 г сефадекса IEF в 225 мл воды, добавить 12 мл 40%-ного раствора фармалитов, деаэрировать эту густую суспензию, залить ею рамку для геля, разровнять поверхность, а затем, закрыв горлышко флакона марлей, подсыпать из него сухой гель равномерно на поверхность слоя до тех пор, пока не будет достигнута консистенция, сохраняющаяся без сдвига при наклоне пластинки на 45е.
Впрочем, авторы одной из недавних работ обходились без таких ухищрений. Они суспендировали 8 г сефадекса G-75 «Superfine» в 100 мл смеси раствора амфолинов и белкового препарата, перемешивали в течение нескольких минут, заливали эту почти 8%-ную суспензию на поднос в рамку и без дальнейшего подсушивания приступали к ИЭФ в приборе «Мультифор» [Legraverend, Glazer, 1980].
Внесение препарата
Для препаративного ИЭФ препарат вносят либо во всем объеме геля, растворяя белки в смеси амфолитов до засыпки сефадекса, либо в виде полоски на всю ширину слоя в определенном его месте. Последнюю операцию можно осуществлять как до формирования градиента pH в геле, так и после него — в зависимости от лабильности белков. Для внесения препарата-в толщу геля до самого его дна вдавливают узкую прямоугольную стальную рамку с острыми краями вместимостью 4—5 мл, перекрывающую всю ширину геля. Из нее шпателем выскребают сефадекс, смешивают его с раствором препарата и амфоли-тов (не более 3 мл) и возвращают эту смесь на прежнее место (рис. 16). Затем рамку вынимают и дают краям области нанесения сравняться за счет гидростатических сил с остальной массой геля. Если препарат содержит много соли, ее следует удалить диализом.
Электрический режим ИЭФ
Поднос с гелем устанавливают на охлаждающий столик прибора, обеспечивая надежный контакт между ними, как обычно, с помощью слоя раствора детергента. По коротким сторонам подноса на гель накладывают в три слоя полоски смоченной электролитами фильтровальной бумаги или специальные фитили (если ими комплектуется прибор) и прижимают их электродами той или иной конструкции.
Для 100 мл исходной суспензии сефадекса в приборе «Мультифор» фирма «LKB» рекомендует использовать режим постоянной мощности (около 8 Вт) при температуре охлаждающей жидкости 10°. Этому отвечает начальный режим с напряжением 350—400 В при силе тока 20—23 мА для диапазонов pH 2,5—4,5 и 7—Ю — амфолины этих диапазонов отличаются повышенной
Рис. 16. Внесение препарата в елей сефадекса для препаративного ИЭФ
JVl5- *7- Извлечение белковой полосы вместе с сефадексом после окончания ИЭФ
электропроводностью. Для диапазонов вблизи нейтрального значения pH начальное напряжение можно выбирать в пределах 500—650 В при силе тока 12—16 мА. К концу формирования градиента pH ток ослабляется примерно вдвое при соответствующем увеличении напряжения (постоянная мощность). В таком режиме процесс ИЭФ белков занимает 14—16 ч. Фирма «Pharmacia» на своем приборе FBE-3000 рекомендует проводить ИЭФ в слое гранулированного геля размером 20Х20Х Х0,5 см при мощности 30—60 Вт. При этом фракционирование белков заканчивается за 4—6 ч. Соображения по поводу выбора диапазона pH и концентрации амфолитов, допустимого содержания солей и т. д. остаются теми же, что при аналитическом ИЭФ в ПААГ и гелях агарозы.
Обнаружение я элюцня белков
Для этих целей с поверхности геля делают отпечаток («реплику»), фиксирующий положение сфокусированных белковых зон. Лист фильтровальной бумаги, например «Whatmann 1ММ.», вырезают по размерам геля. Сняв электроды и полоски бумаги под ними, накладывают лист фильтровальной бумаги на гель, начиная с одного конца, так чтобы избежать задержания воздуха между бумагой и поверхностью геля. В течение 2 мин дают ‘бумаге впитать в себя жидкость из слоя геля. Вместе с раствором амфолитов из зон своего фокусирования на бумагу переходят в небольшом количестве и белки. Бумагу осторожно снимают и высушивают при 110—120° в течение 10—15 мин, а затем промывают трижды по 15 мин в 10%-ной ТХУ. Эта операция ¦фиксирует белки в тех местах реплики, которые находились над сфокусированными зонами в геле. Наконец, белки на бумаге окрашивают 0,2%-ным раствором СВВ R-250 в смеси, содержащей 10% CHjCOOH и 50% метанола. Отмывку фона производят в том же растворе без красителя, с несколькими его сме-
