Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
При использовании методов 2 и 3 белок быстрее достигает своего изоэлектрического положения, чем при внесении в весь объем колонки. Особенно это относится к методу 3, который следует предпочесть при фокусировании нестойких белков. Как и при других методах ИЭФ, содержание соли в белковом препарате желательно свести к минимуму. Для колонки объемом 110 мл максимально допустимое количество соли в препарате составляет 0,5 ммоль, для колонки объемом 440 мл— 1,5 ммоль. В случае необходимости для сохранения растворимости белка соль в растворе препарата можно путем диализа заменить на 1%-ный раствор глицина.
Рабочий режим ИЭФ
При температуре охлаждающей воды 4° фирма рекомендует не превышать электрической мощности в 15 Вт для колонок объемом 110 мл и 30 Вт — для колонок объемом 440 мл. Во избежание образования локальных точек перегрева рекомендуется также не превышать значений напряжения 1600 и 2000 В соответственно. В начале ИЭФ при указанных значениях мощности напряжение может быть заметно ниже. Например, для хорошо проводящих ток амфолинов диапазона pH 9—11 оно может составлять 1000 В, а для pH 2,5—4 — около 800 В. В ходе формирования градиента pH напряжение растет до указанных предельных значений, а далее его поддерживают неизменным. В этих условиях фокусирование белков заканчивается за 15—20 ч. Необходимую продолжительность ИЭФ следует установить экспериментально — по результатам фокусирования. Даже об окончании формирования градиента pH нельзя судить по кажущемуся прекращению падения тока, так как вблизи положения равновесия амфолины мигрируют очень медленно. Тем более это относится к белкам.
Эту операцию производят через нижиее, снабженное краном отверстие в следующей последовательности. Отключают напряжение и, подняв клапан, запирают электролит в центральной трубке. Во избежание подтекания его лучше из трубки отсосать. Из рабочего объема колонки сверху отсасывают верхний электродный буфер и до предела заполняют верхнюю часть колонки водой. Затем к отростку, ведущему в рабочую камеру, плотно присоединяют выходную трубку перистальтического насоса и открывают сливной кран. Жидкость из колонки будет вытекать только по мере подачи воды от перистальтического насоса в верхнюю часть камеры. Скорость этой подачи можно регулировать. Фирма рекомендует опоражнивать колонку со скоростью 60—80 мл/ч. Элюат из колонки через денситометр направляют в коллектор фракций. Во фракциях измеряют pH (при температуре фокусирования!). Если ультрафиолетовое поглощение оказывается недостаточным, наличие белков во фракциях определяют в аликвотах с помощью окрашивания или других описанных выше методов обнаружения белков. Отобранные фракции объединяют и отделяют в них белки от амфолинов.
Специфические проблемы
Одна из них связана с самим градиентом плотности. Выполняя свою основную функцию подавления конвекции в жидкости, он, как это ни парадоксально, в определенной мере эту конвекцию и стимулирует. Для уменьшения опасности перемешивания слоев жидкости желательно обеспечить строгое постоянство ее температуры по всей высоте колонки. С этой целью стараются добиться неизменности электрического сопротивления амфолитов вдоль всего градиента pH. Между тем электрофоретическая подвижность любых ионов, в том числе и амфолитов, уменьшается с увеличением вязкости среды. Именно это происходит с амфолитами, оказавшимися в нижней части колонки, в среде плотного раствора сахарозы. В результате этого электрическое сопротивление и тепловыделение будут нарастать по направлению от верха к дну колонки и нижние слои жидкости, несмотря на охлаждение, будут нагреваться несколько сильнее, чем верхние, а это как раз и вызывает конвекцию.
Выбор полярности электродов
Иногда описанный эффект можно в определенной мере компенсировать правильным выбором полярности электродов. Ранее отмечалось, что электропроводность амфолитов, обеспечивающих область нейтральных значений pH, заметно ниже, чем у амфолитов кислой и щелочной областей градиента pH. В тех случаях, когда градиент перекрывает не весь возможный
диапазон значений pH, а сдвинут в кислую или щелочную область, имеет смысл так выбрать расположение электродов, чтобы экстремальные значения pH лежали в нижней части колонки. В этом случае повышенная электропроводность амфолитов, обеспечивающих эти значения pH, будет компенсировать снижение их подвижности вследствие повышенной вязкости среды. Так, если фокусирование предполагают вести в диапазоне pH 7—10, то имеет смысл внизу расположить катод, а для диапазона pH 3—7 нижний электрод лучше сделать анодом.
Здесь уместно напомнить об опасности возникновения слоя чистой воды и целесообразности использования смесей амфолитов разных диапазонов pH, а также о рациональном выборе электродных электролитов для обеспечения плавного характера перехода от рабочих змачений градиента pH к электродам. Эти вопросы были подробно рассмотрены выше.
Выбор полярности электродов зависит не только от приведенных соображений, относящихся к проблеме конвекции. Он должен учитывать еще некоторые обстоятельства, например положение зоны очищаемого белка по высоте колонки. В процессе элюции, когда электрическое поле выключено, идет диффузионное и гидродинамическое (при истечении) размывание белковых зон, поэтому естественно выбрать полярность электродов таким образом, чтобы интересующая зона оказалась в нижней части колонки.
