Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Опасность выпадения осадков
Есть еще одно, специфическое для данного метода обстоятельство — опасность выпадения белков в осадок вблизи их изоэлектрической точки. Вертикальное расположение колонки и жидкая среда придают этой опасности особое значение. Дело не в том, что выпавший в осадок белок может сильно повлиять на электропроводность окружающего его раствора амфолитов— для этого осадок должен быть слишком плотным. Опасно другое: белковые осадки могут постепенно оседать на дно
колонки, нарушая плавность градиента pH и загрязняя лежащие ниже зоны. На ранних этапах очистки белков, когда их содержание в исходной смеси невелико, такая ситуация вполне реальна; именно она может оказаться решающей для выбора полярности электродов. Фокусирование нужных белков может пройти вполне успешно несмотря на образование осадков, если зона фокусирования окажется лежащей выше области осаждения. Правда, в этом случае во избежание загрязнения очищаемого белка частицами осадка элюировать колонку лучше не через нижний сливной канал, а через верхний отросток, используемый для ее заполнения. С этой целью концентрированный раствор сахарозы подают от насоса через сливной канал в нижнюю часть колонки.
Геометрия верхней части колонки и боковое расположение отростка не благоприятствуют хорошему отделению близколе-жащих зон. Фирма «LKB» в этом случае рекомендует другой, более эффективный, хотя и более сложный способ — вводить в рабочую камеру сверху через тот же отросток полиэтиленовую трубочку и отсасывать градиент слой за слоем, опуская кончик трубочки всякий раз на одинаковую глубину под уровень жидкости в камере. Для более полного сбора каждой фракции на нее предварительно можно наслоить немного воды, а кончик трубочки загнуть на 180° и расширить, придав ему форму маленькой воронки. Таким способом можно отсосать и слой выпавшего в осадок белка, если этот осадок не настолько плотный, чтобы опускаться на дно камеры.
Проблема растворимости
В последнем замечании содержится намек на то, что опасность выпадения осадка в изоэлектрической точке существует и для самих очищаемых ИЭФ белков. Это действительно так, что иногда заставляет принять особые меры по увеличению растворимости этих белков. Иной раз присутствие сахарозы неблагоприятно сказывается на растворимости белка. В этом случае следует построить градиент плотности путем добавления к раствору амфолитов глицерина (до 60%). этиленгликоля (до 75%) или сорбита (до 50%). Кстати, если фокусирование пред* полагается вести при рН>9, то сахарозу вообще лучше заменить сорбитом. В щелочной области pH сахароза диссоциирует как слабая кислота и может нарушить характер градиента pH, образуемого амфолитами.
Иногда улучшения растворимости белка вблизи изоэлектрической точки можно добиться увеличением концентрации самих амфолитов до 3—4%. Наконец, в распоряжении экспериментатора всегда остается возможность испробовать испытанный способ увеличения растворимости белков путем введения в жидкую среду солюбилизирующих добавок. Разумеется, они должны иметь неионный характер или быть заведомо нейтральными цвиттерионами. В качестве таких добавок можно использовать мочевину или неионные детергенты, например Тритон Х-100, NP-40 и Brij-35, а в качестве нейтрального цвиттериона можно взять глицин. О солюбилизирующих добавках было достаточно подробно сказано в гл. 2. Здесь только отметим, что в присутствии сахарозы при 4° мочевина может частично кристаллизоваться из раствора. Это обстоятельство надо иметь в виду при выборе концентрации мочевины (не более 6 М) и температуры охлаждающей воды.
Максимальная загрузка
Рассмотрим теперь существенный для препаративных опытов вопрос о максимальной загрузке электрофокусирующих колонок фирмы «LK.B». Предел допустимой загрузки белковой зоны зависит от растворимости очищаемого белка вблизи его и з оэ л октр и ч е с к о й точки, от буферной емкости амфолитов в области фокусирования зоны и от способности градиента плотности поддерживать сфокусированную белковую зону в месте ее образования несмотря на локальное повышение плотности раствора за счет концентрирования в нем белка. Во всех этих аспектах условия для успешного фокусирования оказываются тем менее благоприятными, чем уже зона фокусирования белка, т. е. чем более крутой градиент pH используется для ИЭФ. Поэтому в интересах максимальной загрузки полезной зоны при препаративной очистке белка имеет смысл использовать пологие градиенты pH (т. е. узкие диапазоны pH), тем более что в этом случае балластные белки оттесняются дальше к аноду или катоду. Разумеется, для этого в предварительном аналитическом опыте надо определить значение pi очищаемого белка. Для ориентировки можно указать, что загрузка одной зоны в колонке объемом 110 мл может составлять 5—25 мг белка, а для колонок объемом 440 мл ее можно увеличить до 20—80 мг IRighetti, Drysdale, 1976]. Для смеси белков, состоящей из 10 основных компонентов, это означает, что на колонки «LKB» можно нанести до 250 и 800 мг исходного белкового препарата соответственно, т. е. примерно столько же, сколько при ИЭФ в горизонтальных пластинах гранулированного геля. Впрочем, в литературе встречаются сведения и о заметно 'больших загрузках—вплоть до нескольких граммов белка на колонку объемом 440 мл.
