Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ ПЕРПЕНДИКУЛЯРНО ГРАДИЕНТУ pH
В заключение следует упомянуть о таком способе анализа белков, когда в первом направлении пластины геля ведут фокусирование одних только амфолитов, т. е. формирование градиента pH. Затем в такой пластине проводят электрофорез белков в перпендикулярном направлении. Таким способом можно подобрать оптимальное значение pH для электрофоретического разделения смеси белков или провести анализ изменения подвижности данного белка в геле в зависимости от pH* Препараты для разделения во втором направлении можно наносить раздельно, и тогда миграция будет идти в параллельных треках при различных, изменяющихся от трека к треку значениях pH. Исходный препарат можно нанести и одной полоской поперек всего градиента pH. В этом случае будут получены кривые сигмоидного вида, содержащие информацию того же типа, что и кривые титрования белков. В частности, по ним можно обнаружить различия в аминокислотном составе различных вариантов одного белка [Gianazza et al., 1980].
Глава 4
ПРЕПАРАТИВНЫЕ ВАРИАНТЫ ИЭФ
ИЭФ В СЛОЕ ГРАНУЛИРОВАННОГО ГЕЛЯ
Этот способ препаративного ИЭФ в настоящее время вытесняет широко распространенное ранее использование градиента плотности раствора сахарозы. Его преимущества — простота* высокая емкость и относительная нечувствительность к выпаде-
нию некоторых компонентов белковой смеси в осадок вблизи-изоэлектрической точки. Кроме того, открытый доступ к поверхности фокусирующей среды позволяет описанным ниже способом снимать «реплики» расположения белковых зон для контроля за ходом фракционирования и локализации белков по его окончании. Простой метод элюции белков после извлечения соответствующих участков геля устраняет неизбежное для градиентов: сахарозы разбавление, а иногда и смешивание белковых зон.
Отличительная особенность метода состоит в том, что ИЭФ белков происходит в водном растворе амфолитов, находящемся между гранулами набухшего сефадекса или другого инертного гидрофильного и гранулированного геля. Назначение геля состоит в подавлении возникновения конвекционных токов в жидкости. Вместе с тем, он достаточно мелкопорист для того, чтобы внутренний объем гранул оставался недоступным для белков. Относительно толстый, но ровный и открытый слой такого гранулированного геля располагается горизонтально. ИЭФ можно> производить с помощью приборов для электрофореза в горизонтальных пластинах, например типа «Мультифор».
Приготовление рабочего слоя геля
Эта операция сводится к смешиванию сухого сефадекса G-75 «Superfine» с 2%-ным раствором амфолитов нужного диапазона pH. Для очистки определенного белка удобно воспользоваться амфолитами с узким диапазоном pH, если, конечно, значение pi для этого белка уже известно. Это позволяет оттеснить посторонние белки на концы слоя геля, а также увеличить его загрузку. Продажные препараты сефадекса содержат водорастворимые ионогенные примеси, могущие заметно нарушить нормальный ход формирования градиента pH, поэтому сефадекс надо предварительно тщательно промыть водой. Порцию сухого сефадекса высыпают с перемешиванием в 25 объемов воды и-после 10-минутного набухания суспензию выливают на стеклянный фильтр с размерами пор в интервале 20—40 мкм. Кашицу сефадекса без суспендирования промывают на фильтре еще-
5-кратным по сравнению с указанным количеством воды (эта операция занимает около 5 ч), а затем обезвоживают, пропуская несколько порций абсолютного этанола. Гель заметно сжимается. Затем его сушат в течение ночи в вакууме. Важность операции отмывки сефадекса иллюстрирует рис. 15.
Фирма «LKB* предлагает для ИЭФ специально промытый: сефадекс под названием «Ultrodex»; им можно пользоваться без дополнительной промывки. Аналогичный продукт фирмы «Pharmacia» носит наименование «Sephadex IEF». Фирма «Bio-Rad» для этой же цели предлагает хорошо очищенный гранулированный гель на основе полиакриламида с пониженным содержанием остатков акриловой кислоты (эндосмос!) под названием «Bio-Lyte Electrofocusing gel».
Навеску промытого порошка сефадекса (или одного из названных фирменных гелей) медленно, с перемешиванием высыпают в стакан с 2%-ным раствором амфолитов с таким расчетом, чтобы получить 4%-ную суспензию, считая по отношению сухого веса сефадекса к конечному объему смеси. Не следует выливать раствор амфолинов на сухой гель — это приведет к образованию комков. Суспензию тщательно, но осторожно, чтобы не измельчать гранулы, перемешивают и, не дожидаясь полного набухания сефадекса, выливают на специальный поднос для формирования слоя гранулированного геля. Установленный строго горизонтально, поднос представляет собой прямоугольную стеклянную пластинку, соответствующую размерам охлаждающего столика прибора и ограниченную рамкой из силиконовой резины. 70—100 мл суспензии заливают таким образом, чтобы полужидкий ровный слой имел толщину 3—4 мм. Затем гель подсушивают до такой консистенции, когда на поверхности геля уже не видно влаги, но в его толще еще не возникают микротрещины. Это — довольно деликатная операция, и фирма «LKB» рекомендует контролировать ее ход по весу геля. Предварительно взвесив пустой поднос, можно следить за уменьшением веса геля в ходе подсушивания и прекратить его, когда содержание влаги уменьшится на 39—40%. Само подсушивание фирма рекомендует осуществлять с помощью вентилятора, установленного на высоте 70 см над пластиной, без подогрева воздуха. К моменту окончания подсушивания поверхность геля должна оставаться гладкой, а при наклоне в 45° он не должен сползать. Вся операция занимает около 2 ч.
