Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
При изотахофорезе белков их концентрация соизмерима с концентрацией быстро мигрирующего иона, вначале заполняющего весь объем геля. Электрофоретическая подвижность замыкающего иона, находящегося первоначально в верхнем электродном резервуаре, остается все время меньше, чем подвижность самого медленного из белков смеси. При включении электрического тока быстро мигрирующий ион буфера опять отходит к нижнему электроду, но теперь вплотную за ним еле-дуют сами белки, выступающие в роли переносящих ток ионов.
Постепенно они выстраиваются в порядке убывания их электрофоретических подвижностей. Замыкает цепочку ион верхнего резервуара. В установившемся режиме вся эта цепь ионов движется вдоль геля с постоянной скоростью (отсюда и название— «изотахофорез»). Напряженность электрического поля ступенчато увеличивается при переходе от зоны одного иона к зоне следующего за ним другого пропорционально последовательному уменьшению электрофоретических подвижностей этих ионов. Это вытекает из условия равенства скоростей миграции асех ионо-в, поскольку скорость миграции определяется произведением электрофоретической подвижности иона на напряженность поля. Требование же равенства скоростей вытекает из очевидного условия непрерывности и постоянства электрического тока вдоль всего геля. Распределение напряженности по зонам миграции каждого из белковых ионов диктуется соотношением электрических сопротивлений этих зон, которые зависят от концентрации в них ионов. Эти концентрации устанавливаются под действием самого поля, за -счет сужения или расширения каждой зоны в зависимости от того, в каком количестве соответствующий белковый ион представлен в исходной смеси белков. В процессе миграции вдоль геля эти зоны сохраняют неизменную ширину.
То обстоятельство, что впереди зоны любого из ионов движется зона с более низкой напряженностью электрического поля, а сзади —зона с повышенной напряженностью, приводит к установлению резких границ между белковыми зонами вопреки диффузии. Действительно, попавший в результате диффузии во впереди идущую зону ион ввиду более низкой напряженности поля в этой зоне замедлит движение и вернется в «свою» зону. Точно так же догонит эту зону ион, диффундировавший в идущую сзади зону повышенной напряженности.
Описанная сортировка белков смеси по зонам в соответствии с их электрофоретическими подвижностями практически бесполезна, так как белки двигаются вплотную друг за другом, что не 'позволяет им надежно разделиться. Однако в исходную белковую смесь можно добавить ионы небелковой природы, которые будут «вклиниваться» между зонами белков и разделять их друг от друга,— так называемые «спейссры». Они могут быть низкомолекулярными, что позволит далее легко очистить от них белки. Например, при изотахофорезе белков сыворотки крови в нее добавляли следующие аминокислоты: аспарагин, глицин и р-аланин [Schafer-Nielsen et al., 1980]. Электрофоретические подвижности этих аминокислот не одинаковы, но лежат внутри диапазона подвижностей, характерных для белков сыворотки. При формировании движущейся цепочки зон ионов каждая из аминокислот вклинивается на соответствующее место, «раздвинув» две соседние белковые зоны. Теперь белки сыворотки разобьются на четыре отделенные друг от друга группы. Число спейсерных добавок можно увеличить,
а концентрацию каждой из них подобрать так, что весь исходный набор белков разобьется на несколько четко ограниченных полос, разделенных легко идентифицируемыми, заранее известными зонами спенсеров. В принципе можно так выбрать опей-серы, что в каждой белковой зоне будет мигрировать только один белок. Разделение белков в этом случае будет идеальным и произойдет очень быстро. Но как подобрать спейсеры, чтобы они встроились именно между белками или хотя бы между теми белками, которые надо разделить, если электрофоретические подвижности этих белков точно не известны? Практически приходится идти долгим путем подбора.
Фирма «LKB» рекомендует примешивать к исходному белковому препарату в качестве спейсеров амфолины. Отличие от ИЭФ здесь в том, что амфолины вносят не в объем геля или жидкости, в которых проводят электрофорез, а только в исходный препарат, причем в таком количестве, которого недостаточно для обеспечения проводимости по всему объему фракционирования. В отличие от ИЭФ, в этом случае зоны расположения амфолинов не перекрываются и сами они не разряжаются, не формируют градиента pH, а мигрируют в качестве ионов наряду с белками, встраиваясь между ними в цепочку зон с убывающей электрофоретической подвижностью. Все амфолины в этой системе несут заряд одного знака, но в зависимости от своих pi различаются по величине этого заряда, образуя тем самым широкий набор спейсеров с различными электрофоретическими подвижностями. При этом pH среды, в которой идет миграция, определяет буферный противоион.
В рассмотренном примере использования аминокислот в качестве спейсеров изотахофорез проводили в 6,4%-ном ПААГ. После окончания фракционирования (формирования четких зон) белки фиксировали и окрашивали в геле красителем СВВ G-250. В приборе «Тахофор» изотахофорез микроколичеств белковой смеси и амфолинов проводят в жидкости, заполняющей длинный (до 80 см), хорошо термостатированный тефлоновый капилляр диаметром 0,5 мм. Препарат вводят с помощью микрошприца. Благодаря низкой концентрации амфолинов и белков, а также большой длине капилляра рабочие напряжения в приборе достигают десятка тысяч и более вольт. Регистрацию белковых зон на выходе из капилляра осуществляют с помощью денситометра по УФ-поглощению при 280 нм. Зоны белков и амфолинов в этом приборе мигрируют быстро, и весь анализ белковой смеси обычно занимает менее часа. Однако главный недостаток метода остается в силе — заранее не известно, какие белки и в какой степени будут раздвинуты амфолина-ми. Концентрацию последних приходится брать низкой, чтобы не помешать проявлению проводимости за счет белков. Но смесь амфолинов многокомпонентна. Количество одной из аминокарбоновых кислот, внесенных в составе этой смеси, например как раз той, которая разобщает два близких по своей подвижности
