Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
только 3Н, т. е. принадлежащие только к одной из двух белковых смесей. Затем изотопные метки этих смесей можно поменять местами [McConkey, 1979].
Для более четкого отделения радиоактивности углерода мож-но сначала высушить гель и провести авторадиографию, а уже затем замочить его снова в воде, импрегнировать сцинтиллято-ром и провести флюорографию аН+14С [Kuhn, Wilt, 1980]. Некоторые сложности здесь могут быть связаны с необходимостью повторного высушивания геля до прежних размеров.
Сканирование пластинок торцевыми счетчиками
Сканирование радиоактивных пятен торцевыми счетчиками: на пластинках после ТСХ и бумаге после хроматографии или электрофореза одно время практиковалось широко, а затем было вытеснено намного более чувствительными методами счета в жидких сцинтилляторах. Однако фирме «Bertholcb (ФРГ) удалось в такой степени усовершенствовать сканирующую аппаратуру и чувствительность торцевых газопроточных счетчиков, что* метод вновь стал конкурентоспособным по чувствительности, а по своей экономичности и быстроте он имеет явное преимущество перед использованием жидкостных сцинтилляционных счетчиков для этой цели. Чувствительность метода возросла в такой мере,, что его можно успешно использовать и для сканирования высушенных пластин после электрофореза в ПААГ.
Сканирующий прибор. Модель «Berthold DC-II» (LB 2723) оснащена торцевым газопроточным счетчиком, работающим на дешевых газах (метане, этане, пропане), с легко сменными, открытыми или закрытыми тонким окошком диафрагмами. Анод из проволоки находится под напряжением до 3000 В. Сильное электрическое поле втягивает р -частицы через щель диафрагмы внутрь счетчика. Пластинки укладывают на столе размером, 20x40 см. Их можно сканировать с различными фиксированными скоростями — от 12 до 30 000 мм/ч. Расстояние между строчками можно регулировать в пределах от 0,1 до 10 мм. На втором,, параллельно перемещающемся столе на бумаге записываются пики интенсивности радиоактивного излучения либо печатаются точки, плотность расположения которых пропорциональна радиоактивности на соответствующем участке пластинки. Во втором режиме получается картина расположения пятен, подобная авторадиографической, а в первом можно получить количественные оценки радиоактивности. Эти оценки, разумеется, носят относительный характер, так как не учитывают выхода радиоактивности из пластинок. Значения этого выхода для пластинок после ТСХ в зависимости от материала и толщины слоя носителя составляют 0,7—3% для 3Н и 15—30% для “С. Это немного по сравнению с приводившимися выше значениями выхода радиоактивности из порошков при счете в жидком сцинтилляторе, ноне уступает выходу радиоактивности при флюорографии.
За 24 ч сканирования на малой скорости прибор может зарегистрировать все пятна радиоактивности с плотностью порядка 10000 расп./мин на 1 см2 для 3Н и 1000 —для ,4С. Высокие активности, в частности пятна 3Ф, регистрируются очень быстро. Сопоставление приведенных данных по чувствительности прибора с данными для флюорографии пластинок после ТСХ показывает, что в этом плане оба метода эквивалентны, но при использовании прибора фирмы «Berthold» отпадает необходимость не только в импрегнировании сцинтиллятора в тонкий слой или гель, но и в расходовании времени и средств на фоторегистрацию. Впрочем, в случае сложной картины с большим количеством пятен (метод О’Фаррелла), по-видимому, разрешающая способность флюорографии будет выше.
Линейный анализатор «Berthold LB 2832». В этом приборе достижения методов исследования элементарных частиц в ядер-ной физике умело использованы для анализа распределения радиоактивности в тонком слое после фракционирования биологических молекул. Если описанное выше сканирующее устройство «читает» каждую «строку» путем перемещения вдоль нее диафрагмы торцевого счетчика (очень медленного при малой радиоактивности— для накопления счета), то в этом приборе вся строка лежит под открытым окном счетчика размером 25X X 1,5 см. Вдоль его оси натянута регистрирующая импульсы проволока анода. Остроумное использование двух электронных «линий задержки» позволило конструкторам прибора «поручить» этой проволоке регистрацию не только амплитуды импульса радиоактивности, как в обычных газопроточных счетчиках, но и местоположения испускания этого импульса вдоль длины проволоки. В принципе —без технических деталей — это достигается сопоставлением времен распространения электрического импульса от места его непосредственного возникновения до концов проволоки — времен, пропорционально увеличенных до наносекунд-ного уровня с помощью линий задержки.
Таким образом, оставаясь неподвижным при «чтении» каждой «строки», прибор одновременно ведет регистрацию всех радиоактивных участков, попадающих на эту строку. Это приводит к увеличению скорости регистрации радиоактивности при заданной чувствительности или (что эквивалентно) к увеличению чувствительности при заданной продолжительности регистрации — примерно в 100 раз. Так, 250 расп./мин трития или 50 расп./мин углерода в одном пятне могут быть зарегистрированы за 20 мин! Конструкция прибора позволяет получить разрешение в 0,5 мм для полос и пятен трития и 1 мм —для “С. Программу счета всей пластинки (выбора строк) и математической обработки результатов измерений, в том числе и сопоставления распределения радиоактивностей в разных треках, можно задать комплектующему прибор счетно-командному устройству («Data System 3500») с выводом результатов в виде графиков и таблиц на телевизионный экран.
