Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 115

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 109 110 111 112 113 114 < 115 > 116 117 118 119 120 121 .. 140 >> Следующая

ВВЕДЕНИЕ “С И Ш
Чаще других с этой целью используют боргидрид натрия. Введение радиоактивности происходит в ходе реакции метили-рования свободных аминогрупп белка по следующей схеме:
Белок — NH2 + 2НСНО + l/2NaBH4
-* Белок - N (СН3)2 + l/2NaH2B03 + 1/2Н20.
Из схемы реакции видно, что 14С можно этим методом ввести в белок только за счет 14С-формальдегида, а тритий может исходно находиться как в формальдегиде, так и в боргидриде натрия. Надо иметь в виду, что NaBH4 в водной среде легко разлагается. Процесс этот несколько замедляется при щелочных значениях pH, но даже при pH 9 и комнатной температуре время полураспада составляет примерно 10 мин, а при pH 8— около 1 мин, поэтому NaBHs обычно хранят в сухом виде, в вакуум-эксикаторе над осушителем и растворяют навеску непосредственно перед использованием. Из-за незначительности обычно используемых количеств боргидрид а такая практика связана с большими потерями. Недавно было отмечено, что раствор NaBHt в 0,1 М NaOH можно хранить при —70° в течение нескольких недель без заметного разрушения препарата [Kuhn, Wilt, 1980].
Реакцию метилирования ведут в слегка щелочном буфере, а боргидрид берут в значительном избытке.
В качестве типичного примера условий рассматриваемой реакции можно процитировать довольно давнюю, но в этом пла-
не не устаревшую работу [Rice, Means, 1971]. Авторы использовали [14С]-НСНО с УА-10 мКи/моль. Продажный препарат в виде 3%-ного раствора (~1 М) разбавляли водой до концентрации 40 мМ. Маточный раствор NaBH4 с концентрацией 5 мг/ /мл в 0,2 М боратном буфере (pH 9) готовили непосредственно перед опытом. 0,1 мг белка растворяли в 0,1 мл того же буфера. Можно подсчитать, что это соответствует концентрации лизина в белковом растворе примерно 0,6—1 мМ. К раствору белка добавляли 10 мкл раствора [14С]-НСНО (до концентрации 4 мМ), затем при 0° (во льду) с интервалами ~30 с 4 раза вносили по 2 мл раствора NaBH4 (двукратный избыток по сравнению с НСНО). Через 1 мин для гарантии использования [*4С]-НСНО вносили еще 10 мкл раствора NaBH4 и очищали белок от всех низкомолекулярных компонентов реакции гель-фильтрацией на сефадексе G-25.
Этим способом удалось включить около 20% от максимального уровня радиоактивности, который мог быть достигнут при диметилировании каждой аминогруппы. При исходной УА формальдегида 10 мКм/ммоль это дает примерно 5X10" имп./ /мин на 1 мг белка. Это в тысячу раз меньше того, что можно получить иодированием, но зато метка сохраняется неизменной неограниченно долго. Уровень включения можно повысить в 4—5 раз за счет использования НСНО с большей удельной радиоактивностью.
Следует отметить, что метилирование аминогрупп лизина изменяет их р/С примерно на 0,5 единицы. Это может не сказаться на физико-химических свойствах белка, но его ферментативную активность следует проверять.
В качестве восстановителя вместо боргидрида иногда используют цианоборгидрид натрия (NaBH3CN). Введение метки идет столь же успешно, но NaBH3CN выгодно отличается устойчивостью в водной среде — реакцию можно вести при pH 7, что может оказаться весьма существенным для некоторых нестойких белков [Dottavio-Martin, Ravel, 1978]. При исследовании этой реакции было отмечено, что ей сопутствует образование цианидов, связывающих часть формальдегида, поэтому формальдегид надо брать с большим избытком. При желании цианиды можно блокировать введением в инкубационную смесь 10 мМ NiCU. Никель, как и другие переходные металлы, образует координационные комплексы с цианидами [Jentoft, Dea-born, 1980].
Введение трития в белок выгоднее вести из боргидрида, чем из НСНО, поскольку боргидриды выпускаются с высокой УА (5—15 Ки/ммоль). В качестве примера приведем условия реакции в одной из недавних работ [Kumarasarny, Symons, 1979].
Исходным радиоактивным материалом служил [3Н]-КВН4 с УА = 13 Ки/ммоль. 100 мКи этого препарата (~0,4 мг) растворяли в 100 мкл 0,1 М КОИ, разливали по 5 мкл (5 мКи), высу-
шипяли r пякуум-экс.икятппй и хпянили r hrm ня п гууии ЫяОН
Перед использованием одну порцию растворяли в 30 мкл 0,01 М КОН. Нерадиоактивный формальдегид использовали в виде 20 мМ исходного раствора. 5 мкг белка (3—5 нмоль лизина) растворяли при 0° в 50 мкл 0,2 М боратного буфера (pH 9), добавляли 3 мкл раствора НСНО (60 нмоль) и через 30 с —1 мкл раствора [3Н]-КВН4 (—170 мкКи, 13 нмоль). Из-за выделения радиоактивного 3Нг работали под тягой!
Таким образом, в смеси обеспечивался примерно трехкратный избыток боргидрида по отношению к лизину и почти пятикратный избыток НСНО по отношению к радиоактивному бор-гидриду. Последнее необходимо для полноты использования радиоактивного предшественника — в предыдущей прописи с радиоактивным НСНО соотношение было обратным. Реакцию вели в течение 20 мин при 0°, с явным запасом времени. Затем для восстановления избытка НСНО добавляли 2 мкл нерадиоактивного 0,01 М. NaBH4 и еще через 20 мин — 0,2 мл 0,4 М. Na-фос-фатного буфера с 0,1 М глицина. Глицин предназначался для полного израсходования радиоактивного предшественника (метилирование глицина по концевой NH2-rpynne).
Предыдущая << 1 .. 109 110 111 112 113 114 < 115 > 116 117 118 119 120 121 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed