Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
По причинам, которые рассмотрены в следующем разделе, гель, пленку и экран при непрямой авторадиографии экспонируют при —70°. Разрешение близко расположенных полос и пятен при непрямой авторадиографии вообще несколько хуже, чем при
прямой. Это легко понять, если принять во внимание, что экран отделен от геля толщиной рентгеновской пленки, а траектории р-частиц и ^-излучение вовсе не обязательно перпендикулярны плоскости геля. Очень заметно ухудшается разрешение при замерзании влажного геля. В тех случаях, когда разрешение играет важную роль, гели следует высушивать или экспонировать без охлаждения, жертвуя некоторой долей чувствительности. Для повышения чувствительности пленки ее целесообразно предварительно... засветить до определенного уровня. Смысл этой неожиданной операции поясняется ниже.
Проявлять пленки фирмы «Kodak» рекомендуется в течение 5 мин при 20° в фирменном проявителе «Kodak liquid X-ray developer». Перед закреплением их надо быстро сполоснуть в 3%-ном растворе СН3СООН. Пленку РМ-1 проявляют согласно инструкции, указанной на упаковке.
Метод непрямой авторадиографии дает выигрыш по чувствительности при регистрации 32Р в 8 раз, а при регистрации Ш1 — в 30 раз. За 24 ч (при —70е) можно надежно обнаружить почернение от пятна с плотностью распределения радиоактивности 32Р в 50 расп./мин на 1 см2, а для 12&1 — 100 расп./мин.
Флюорография
Этот метод регистрации полос и пятен в гелях и на пластин* ках после ТСХ близок к предыдущему в том смысле, что и здесь на пленке регистрируется свет флюоресценции, возбуждаемой за счет энергии р-частиц. Однако, в отличие от непрямой авторадиографии здесь используют не находящиеся вне геля флюоресцирующие экраны, а сцинтилляторы, введенные внутрь самого геля и находящиеся в непосредственном контакте с радиоактивными препаратами. Благодаря такому контакту поглощение энергии р-частиц в геле оказывается сведенным до минимума. Чувствительность метода столь высока, что позволяет уверенно регистрировать положение полос и пятен препаратов, меченных тритием.
Выше упоминался способ замещения воды в ПААГ на толу-ольный сцинтиллятор. Этот способ пригоден для счета радиоактивности, но не для регистрации положения препаратов в геле, поскольку описанные процедуры замещения приведут к размытию пятен и деформации геля. Из-за небольшого объема пластины геля можно обойтись и без растворителя, введя в нее достаточно большое количество собственно сцинтиллятора.
Флюорография пластинок после ТСХ. Такой подход был впервые использован для флюорографического определения положений пятен на пластине после ТСХ в слое целлюлозы. 15 мл 7%-ного раствора ППО в эфире быстро выливали на пластинку размером 20x20 см и, наклоняя ее, равномерно распределяли жидкость по всей поверхности сорбента. Через 3 с пластинку можно уже держать вертикально и помахивать ею до высыхания эфира. Затем, сделав пометки радиоактивными чернилами, на-
кладывали пленку, зажимали через прокладку и экспонировали при —70°. Чувствительность для 3Н позволяла регистрировать за сутки 10 000 расп./мин на 1 см2, т. е. оказалась выше, чем чувствительность по “С при авторадиографии [К- Randerath, Е. Randerath, 1971].
Равномерность распределения ППО можно улучшить, если пластинку поставить в хроматографическую камеру с 7%-ным раствором ППО в ацетоне и дать этому раствору за счет капиллярных сил подняться до конца пластины.
Выше рассмотрена возможность использовать сцинтиллятор без растворителя. Однако эффективность счета и чувствительность метода увеличиваются на порядок, если растворитель все же ввести. При опрыскивании пластинки, покрытой сухим носителем, это сделать несложно. Растворитель может быть и твердым— например, 2-метилнафталин [Bonner, Stedman, 1978], который плавится при 34,5°. При добавлении к нему толуола легко получить жидкую при комнатной температуре смесь, которая затвердевает при улетучивании толуола. 2-Метилнафталин, подобно нафталину, обладает способностью эффективно поглощать энергию ^-излучения и передавать ее сцинтиллятору, т. е. выполнять основную функцию растворителя сцинтиллятора. Авторы опрыскивали свои пластинки 0,4%-ным раствором ППО (его высокая концентрация больше не нужна) в смеси 2-метилнафта-лина и толуола (9:1). Выигрыш в чувствительности по сравнению с исходным методом составил 15 раз. Для пластин ПААГ этот метод, очевидно, не пригоден.
При флюорографии белков и нуклеиновых кислот, сорбированных на нитроцеллюлозных фильтрах или диазобумаге, можно поступать еще проще — окунуть фильтр в 7%-ный раствор ППО в эфире, а затем высушить [Burckhardt, Birnstiel, 1978]. Результат получается несколько лучше, если концентрацию ППО в эфире увеличить до 10%.
Флюорография пластин ПААГ. Плодотворность использования препаратов, меченных тритием, а также стабильной двойной метки 3Н/14С заставила разработать методы флюорографии и для пластин ПААГ. Очевидно, что здесь нельзя обойтись опрыскиванием или даже вымачиванием геля в растворе сцинтиллятора. Сцинтиллятор надо принудительно ввести внутрь геля, а для этого в первую очередь следует заменить воду в объеме геля жидкостью, способной растворять ППО. В качестве такой жидкости можно использовать диметилсульфоксид (ДМСО). Важным преимуществом здесь является относительно малая деформация геля при замене воды в нем на ДМСО. Подробная процедура была предложена в 1974 г. Боннером и Ласки. Сейчас ее, по-видимому, уже можно считать устаревшей (см. ниже), но ввиду чрезвычайно широкой распространенности имеет смысл процитировать ее подробно.
