Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Фотографирование радиоактивных пятен с пластинок в искровой камере «Berthold LB 292». Это устройство также базируется на методах, используемых в физике элементарных частиц. Пластинку после ТСХ или гель после электрофореза (высушенный или нет — в зависимости от уровня и характера радиоактивности) помещают на дно темной камеры, заполненной разреженным газом. Анод в виде частой и тонкой вольфрамовой позолоченной сетки располагается над пластинкой. Каждая р-частица, вылетающая из любого радиоактивного пятна, ускоряется электрическим полем в направлении, перпендикулярном плоскости пластины, возбуждает газовый разряд и дает вспышку света, локализованную над местом вылета частицы из пятна. Эта вспышка фотографируется на поляроидную пленку. Из совокупности вспышек быстро формируются контуры всех пятен, тем более ярких (светлых на темном фоне), чем выше их радиоактивность.
Чувствительность метода колоссальна: 250 расп./мин 3Н или 50 расп./мин !4С в пятне диаметром 0,5 см можно зарегистрировать за 20 мин. Однако резкость границ пятен за счет случайного распределения первоначальных направлений вылета р-частиц хуже, чем при флюорографии. Разрешающая способность — примерно 1 мм. В тех случаях, когда требуется быстро локализовать на пластинке или в пленке геля не слишком близко расположенные друг к другу пятна радиоактивности, метод дает колоссальный выигрыш в скорости и чувствительности их обнаружения. Специальное устройство проектирует полученную фотографию снова на пластинку, так что радиоактивные пятна на ней можно обвести, а затем вырезать для просчета в жидком сцинтилляторе.
С помощью искровой камеры можно наблюдать и распределение радиоактивности в срезах тканей и органов.
РЕГИСТРАЦИЯ РАДИОАКТИВНОСТИ В ПРОТЕКАЮЩЕЙ жидкости
Эффективность методов такой регистрации невелика, поэтому в большинстве случаев экспериментаторы предпочитают просчитывать в жидком сцинтилляторе аликвоты из хроматографических фракций.
Для непрерывной регистрации радиоактивности злюата с колонки употребляют два подхода. Первый заключается в том, что жидкость пропускают через U-образную трубку, устанавливаемую в счетчик на месте флакона, между двумя ФЭУ и заполненную мелкими бусами из твердого сцинтиллятора. Сцинтилляции от ^-излучения возникают только на поверхности бусинок, поэтому эффективность счета составляет всего лишь примерно 0,6% по 3Н и около 25% по иС.
Второй подход к решению проблемы, по существу, соответствует обычной практике счета аликвот в жидком сцинтилляторе*
Часть элюата автоматически отбирается, смешивается с жидким сцинтиллятором и пропускается через тефлоновую трубочку, введенную опять-таки в жидкостной счетчик радиоактивности на место флакона с препаратом. Эффективность счета в такой системе может быть столь же высокой, как при обычном счете радиоактивности в жидком сцинтилляторе. Чувствительность метода определяется долей злюата, которой экспериментатор готов пожертвовать.
Предлагаемый для этой цели прибор той же фирмы «Berthold LB 503» пригоден, в частности, для работы с жидкостными хроматографами высокого давления.
Глава 3
ВВЕДЕНИЕ РАДИОАКТИВНОЙ МЕТКИ В БЕЛКИ
ИОДИРОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ ХЛОРАМИНА Т
Радиоактивный иод довольно легко включается в белок по остаткам тирозина с образованием иодтирозина или дииодтиро-зина. Для замещения протона в бензольном кольце тирозина путем электрофильной атаки нужен катион 1+. Радиоактивный же иод поступает в виде иодида натрия Nal2SI, где иод является анионом, поэтому катализаторами реакции иодирования тирозина служат окислители, способные отобрать у аниона иода два электрона и превратить его в катион, т. е. осуществить переход
Одним из таких катализаторов служит N-хлортолуолсульфа-мид натрия, получивший торговое название «Хлорамина Т». В его молекуле азот, присоединив электрон, стал двухвалентным и подобным кислороду в «стремлении» заполнить снз наружную электронную оболочку.
В инкубационную смесь объемом 10—40 мкл можно ввести до 10 мкг белка, примерно десяти-о = я=о кратное по массе количество Хлорамина Т и 0,1—
1 мКи радиоактивного иода в виде Na*”I. Послед-*1 яий поставляется в виде раствора в 0,1 М NaOH,
Cl поэтому его следует нейтрализовать кислотой до
Хлорамин т pjj 75 — оптимального для иодирования с по-
мощью Хлорамина Т. Препараты без носителя (УА«17 Ки/мг) выпускаются с концентрацией 100 мКи/мл и более 350 мКи/мл. Обычно вполне достаточно первой концентрации.
Можно рекомендовать следующие исходные растворы для проведения реакции иодирования: Na125I — 100 мКи/мл; 0,25 М Ыа-фосфатный буфер, pH 7,5; Хлорамин Т —5 мг/мл в 0,05 М
Na-фосфзтном буфере, pH 7,5; белок — 0,2—0,5 мг/мл в том же буфере; тиосульфат натрия—1,2 мг/мл в том же буфере; Nal или KI —2 мг/мл в том же буфере с 2% сыворотки лошади. Все растворы должны быть свежеприготовленными.
Последовательность операций при иодировании белка такова: в полистироловую пробирку размером 70x12 мм вносят по 10 мкл раствора Nai25I и Na-фосфатного буфера, а затем быстро, с непрерывным перемешиванием (с помощью микромагнитика) добавляют по 10 мкл растворов белка и Хлорамина Т.
